研究與開(kāi)發(fā)
干貨分享丨代謝組學(xué)問(wèn)題集錦之進(jìn)階篇
經(jīng)過(guò)上一期的基礎(chǔ)篇學(xué)習(xí)，想必大家對(duì)代謝組學(xué)這個(gè)神秘的學(xué)科有了更系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。那么如何選擇適合項(xiàng)目的檢測(cè)方法？用什么平臺(tái)做檢測(cè)？大家是不是還很懵，別著急，這期小編就把答案告訴大家。話不多說(shuō)帶著問(wèn)題一起來(lái)讀！
1
代謝組學(xué)檢測(cè)方法是按什么進(jìn)行分類的？
答
主要是根據(jù)研究目的分為靶向、非靶兩大類，近年來(lái)還有擬靶向、代謝流等分類。
靶向：針對(duì)某一類特定的代謝物進(jìn)行檢測(cè)分析，是一種有偏向性的檢測(cè)手段。主要適合驗(yàn)證型研究，獲得目標(biāo)代謝物在不同組別樣本及不同批次樣本中的絕對(duì)含量。定性依賴標(biāo)準(zhǔn)品，定量依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線。
非靶：是對(duì)生物體內(nèi)源性代謝物進(jìn)行系統(tǒng)全面的分析，獲取盡可能多的代謝物數(shù)據(jù)，找出組間差異代謝物，是一種無(wú)偏向的代謝組學(xué)分析。主要適合發(fā)現(xiàn)型研究，定性主要依靠數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果相對(duì)定量。
擬靶向：結(jié)合靶向和非靶的優(yōu)點(diǎn)，在方法建立時(shí)，用高分辨質(zhì)譜獲取代謝物的離子對(duì)信息，而在實(shí)際樣品分析時(shí)采用靶向的多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）方式測(cè)量代謝物的濃度。
代謝流：是利用穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)，檢測(cè)下游代謝產(chǎn)物的同位素取代形式（M+0/ M+1/ M+2/ …），從而分析出該化合物在代謝通路中的流向和分布。通過(guò)對(duì)生物體進(jìn)行代謝流分析，可得到生物體特定代謝通路的活躍程度。
2
怎么選擇檢測(cè)平臺(tái)？
答
不同平臺(tái)有各自的優(yōu)勢(shì)，比如NMR的重現(xiàn)性好樣品無(wú)損，LC所需樣品較少靈敏度高，GC適合可揮發(fā)性的代謝物。
根據(jù)關(guān)注的代謝物和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)選擇，比如想測(cè)脂蛋白亞類，就只有NMR平臺(tái)可以滿足要求；想測(cè)脂肪酸，主要就靠GC-MS；想測(cè)低濃度的神經(jīng)遞質(zhì)，要用UPLC-QQQ-MS。如果想測(cè)非靶，主要用NMR和QTOF-MS來(lái)完成。
3
代謝組學(xué)檢測(cè)怎么設(shè)置質(zhì)控？
答
質(zhì)控樣：一般選擇將該批次所有檢測(cè)樣本混合，檢測(cè)過(guò)程與正式樣本相同，在該批次前后走若干針，檢測(cè)樣品中固定間隔走一針。監(jiān)控整個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，易發(fā)現(xiàn)因系統(tǒng)污染、儀器故障（如靈敏度下降、保留時(shí)間變化、質(zhì)量準(zhǔn)確度變化）引起的問(wèn)題。
平行樣：選擇不少于樣品總數(shù)5%的樣本分成平行3份，貫穿整個(gè)樣品制備、檢測(cè)和分析過(guò)程。監(jiān)控實(shí)驗(yàn)全過(guò)程的穩(wěn)定性。
4
定量限、檢測(cè)限是什么意思？
答
定量限（LOQ）是指在某一指定水平的準(zhǔn)確度和精密度下能夠可靠定量的最低濃度。
檢測(cè)限（LOD）是指能被可靠檢測(cè)的最小濃度。LOD與體系的信號(hào)和噪聲有關(guān)，通常被定義為信噪比大于3倍。
5
什么是MRM？
答
MRM：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，multiple reaction monitoring。MRM基于目標(biāo)分子的信息，有針對(duì)性的選擇數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，對(duì)于符合目標(biāo)離子規(guī)則的信號(hào)（母離子-子離子對(duì)）進(jìn)行采集，去除不符合規(guī)則的離子信號(hào)的干擾。允許符合設(shè)定的母離子進(jìn)入碰撞室，碰撞完成后，只記錄設(shè)定子離子信號(hào)。
6
什么是基質(zhì)效應(yīng)？
答
是指基質(zhì)對(duì)分析方法準(zhǔn)確測(cè)定分析物的能力的干擾。普遍認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生是質(zhì)譜離子源中樣品離子化過(guò)程中，由內(nèi)源性或外源性基質(zhì)物質(zhì)與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)電荷和中和離子化過(guò)程引起的。生物樣本中的很多物質(zhì)都可能產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，內(nèi)源性的通常是存在于生物樣本中的一些有機(jī)物（蛋白質(zhì)，脂肪，磷脂等）和無(wú)機(jī)物，可能還包括體內(nèi)形成的一此代謝產(chǎn)物。外源性的來(lái)自于樣品制備過(guò)程或者樣本處理中引入的外來(lái)物質(zhì)，比如抗凝劑。
7
如何避免和消除基質(zhì)效應(yīng)？
答
在樣品的前處理階段，可以選擇性的去除干擾物，比如蛋白沉淀；選擇合適的內(nèi)標(biāo)，抵消和降低不利影響；調(diào)整合適的液相分離條件；稀釋樣品；選擇合適的API離子源和離子極性。
8
是不是有標(biāo)準(zhǔn)品就可以定量檢測(cè)？
答
不是，標(biāo)準(zhǔn)品的具備是定性和絕對(duì)定量的必需條件，但是要從生物樣本中檢測(cè)到目標(biāo)代謝物，需要建立合適的方法（樣品制備、色譜分離、質(zhì)譜檢測(cè)等），這個(gè)過(guò)程需要有豐富方法開(kāi)發(fā)的工作者投入大量時(shí)間來(lái)完成，即便如此，方法開(kāi)發(fā)也依舊有失敗的風(fēng)險(xiǎn)，比如目標(biāo)物極不穩(wěn)定。
9
為什么有些代謝物的檢測(cè)需要衍生化？
答
主要是為了改善目標(biāo)物的響應(yīng)、極性、穩(wěn)定性和分離性能。比如將紫外吸收官能團(tuán)引入可提高靈敏度、將熱不穩(wěn)定的代謝物衍生后提高穩(wěn)定性等。
10
質(zhì)譜中 TOF、QQQ、QTRAP、Orbitrap 都代表什么？
答
這些都是質(zhì)譜中常見(jiàn)的質(zhì)量分析器。
TOF（times of flight 飛行時(shí)間）：不同的離子可通過(guò)電場(chǎng)加速至同樣的動(dòng)能，而其速度由質(zhì)荷比決定。因此可用飛行時(shí)間技術(shù)測(cè)量速度從而得知質(zhì)荷比。特點(diǎn)是分辨率高、靈敏度低，適合非靶研究。
QQQ（triple quadrupole 三重四級(jí)桿）：由三個(gè)依次串聯(lián)的四極桿組成，其中第一個(gè)四極桿（Q1）和第三個(gè)四極桿（Q3）用作質(zhì)量過(guò)濾器，第二個(gè)四極桿（Q2）用作離子碰撞室。特點(diǎn)是靈敏度高、分辨率低，適合靶向定量研究。
QTRAP: 四級(jí)離子阱，是以QQQ為基礎(chǔ)，第三個(gè)四級(jí)桿（Q3）即可以做三重四級(jí)桿也可以做線性離子阱，具有三重四級(jí)桿的掃描功能，兼具線性離子阱的高靈敏度定性掃描和多級(jí)掃描功能，以及三重四級(jí)桿和線性離子阱結(jié)合在一起的掃描功能。
Orbitrap: 軌道離子阱，為T(mén)hermo公司獨(dú)有技術(shù)，被用于高分辨的質(zhì)譜分析平臺(tái)。
