文獻分享 | The EMBO Journal 新冠病毒免疫病理學和多器官損傷的血液分子標志物
新冠肺炎(COVID-19)已鑒定為SARS-CoV-2病毒感染，表現(xiàn)為免疫應答失去調節(jié)能力，代謝功能紊亂和多器官損傷。目前，新冠肺炎的全球疫情仍不容忽視，截至2021年6月27日，全球現(xiàn)存確診病例29526909例，累計死亡2889592例。2020年，國際知名期刊EMBO J發(fā)表了一項來自復旦大學人類表型組研究院的研究內容，研究者對66例不同病程的新冠肺炎感染者的血液進行了轉錄組學，蛋白質組學和代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)了在輕癥和重癥肺炎患者體內，許多組織特異性蛋白和胞外RNA具有顯著改變。在肺炎向重癥發(fā)展的病程中，中性粒細胞，IFN信號通路呈現(xiàn)慢性激活，炎癥細胞因子水平升高；而輕癥患者表現(xiàn)為強健的T細胞效應。這些結果是新冠肺炎發(fā)展和預后的重要指征，對了解預測新冠肺炎的病理生理學和疾病發(fā)展具有重要意義。
1. COVID-19 感染患者的免疫病理學變化
從66名不同病情的患者以及 17 名健康志愿者收集了血液和咽拭子樣本（圖1A）。為了確定 COVID-19 病理生理學是否與特定的分子變化相關，研究者結合轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學的多組學方法檢查了總共 23,373 個表達基因、9,439 個蛋白質、327 個代謝物和 769 個 exRNA（圖 1B）。與健康對照相比，輕度和重度患者的表達基因有6.79%上調和26.0%的下調；這一表達模式（上調/下調）在蛋白質水平為52.1%和51.7%，在代謝物水平為7.34%和15.6%，在exRNAs中為 39.9%和20.5%（圖 1C）。
圖1.實驗設計和組學數(shù)據(jù)結果
值得注意的是，多組學數(shù)據(jù)與經(jīng)典血液和生化參數(shù)之間存在顯著相關性：輕癥和重癥患者的三羧酸循環(huán) (TCA) 和糖酵解途徑均顯著下調。然而，這些患者的缺氧誘導因子 (HIF-1) 信號通路和宿主防御通路（T 細胞受體信號通路、ISG15 抗病毒信號通路）升高（圖 2A）。此外，加權基因共表達網(wǎng)絡分析 (WGCNA) 將蛋白質組圖譜分成 33 個共表達模塊 (ME0-ME32)。其中，六個模塊顯示出與臨床參數(shù)的顯著相關性（圖 2B），特別是和活化部分凝血活酶時間 (APTT) 密切相關，其表達下調可能表明 APTT 值較高（圖 2C）。相比之下，患者的血漿 IL-6 和 IL-10 水平與模塊 15 中的蛋白質表達呈正相關（圖 2D）。除蛋白質外，脂蛋白變異也與免疫變化顯著相關，包括 IgG、單核細胞和降鈣素原。綜合起來，這些數(shù)據(jù)表明特定分子變異與 COVID-19 感染患者的病理生理變化之間存在關聯(lián)。
圖2. 與COVID-19病理生理學相關的蛋白質水平改變
輕度和重度患者血漿中肺增強蛋白的差異很大。在所有患者中都觀察到 HIF-1 信號通路和活性氧代謝過程的激活（圖 3D）。肝和腦增強蛋白也有顯著差異，其次是來自睪丸、腸和其他器官的蛋白（圖 3A）。同時，研究者還觀察到調節(jié)神經(jīng)遞質合成（GLS、OGDH、DLD 等）、神經(jīng)遞質轉運（GLUL、GLUD2、GLUD1）和神經(jīng)遞質受體（HTRA3、GRIK3 和GRIA3)，以及包括 ENO1、MBP 和 NEFM 在內的蛋白質顯著減少（圖 3C 和 F）。調節(jié)甾醇和膽固醇轉運的肝臟增強蛋白下調，而在輕度和重度患者中參與急性炎癥反應的蛋白升高（圖 3E）。參與細胞周期和細胞增殖的睪丸增強蛋白在所有男性患者中均上調，盡管與生殖相關的蛋白（例如 YBX2）顯著下調。在 COVID-19 感染患者中，與心肌收縮和氧化還原相關的心臟特異性蛋白質減少（圖 4C）。
圖3. COVID-19患者組織特異性蛋白質改變
研究者還研究了不同細胞群的相對比例和組織損傷相關 exRNA 的表達。（圖 4A 和 B）。例如，肺泡 1/2 型上皮細胞（AT1 和 AT2）表達的一組蛋白質在所有患者中均顯著下調（圖 4B）。此外，在所有組織中，大多數(shù)與組織損傷相關的 exRNAs 顯示出差異表達。一些組織增強蛋白和組織損傷相關 exRNA 的變異也與 COVID-19 的嚴重程度有關。例如，富含微管蛋白積累的腦增強蛋白在輕度疾病患者中上調。這些數(shù)據(jù)表明 COVID-19 可能影響多個器官。
圖4. COVID-19患者組織損傷
3. COVID-19 感染患者免疫病理學變化
全血轉錄組數(shù)據(jù)分析顯示，在整個住院期間，重癥患者的 IFN 信號持續(xù)激活（圖 5A），與輕度患者相比，重癥患者的 IL-6、IL-8 和 IL-10 水平顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明 IFN-I 信號的持續(xù)激活和高水平的炎性細胞因子可能會影響 COVID-19 的免疫病理學。
對中性粒細胞轉錄組特征的檢查表明，中性粒細胞過度激活與嚴重而非輕度疾病有關。值得注意的是，編碼與中性粒細胞胞外陷阱（NETs）相關分子的基因在嚴重疾病患者中顯著上調（圖 5B）。由于過量的 NET 形成會導致組織損傷，研究者的數(shù)據(jù)表明中性粒細胞的過度激活可能有助于 COVID-19 的發(fā)病機制。
與可以通過強 T 細胞反應清除的流感病毒一樣，輕癥患者的 SARS-CoV-2 免疫力的特點是強大的 T 細胞反應，反映在入院時 T 細胞信號激活（M7.3 模塊、M35.1 模塊）和 T 細胞分化（M19 模塊），隨后迅速減少（圖 5A））。表明T 細胞反應對于成功抵御 SARS-CoV-2 的宿主防御是必不可少的。
圖5. COVID-19患者免疫應答差異
4. COVID-19感染患者脂蛋白代謝的綜合變化
為了揭示 COVID-19 感染患者的代謝變化，研究者量化了代謝物、脂蛋白亞類的 348 個代謝物參數(shù)。PCA 評分圖顯示出明顯的與病程變化相關的代謝組學軌跡（圖 6A）。因此，血漿代謝物的濃度變化與 COVID-19 的嚴重程度有關。
進一步的統(tǒng)計分析突出了脂蛋白亞類及其組成成分的主要變化，包括 LDL1 (L1TG)、LDL4、VLDL5、HDL1 和 HDL4（圖 6C ）。與健康對照組相比，輕度和重度患者的LDL1中的甘油三酯（TG）和VLDL5所有脂質中的游離膽固醇（FC）水平均顯著升高，而LDL4和LDL5、LDL中的膽固醇、膽固醇酯均顯著降低。幸運的是，大多數(shù)這些脂蛋白在患者出院后恢復（圖 6B和C).
參與脂蛋白代謝的一些關鍵蛋白質，包括可溶性低密度脂蛋白受體 (sLDLR)、卵磷脂膽固醇酰基轉移酶 (LCAT) 和膽固醇酯轉移蛋白 (CETP)，在輕度和重度 COVID-19 中顯著降低。（圖 6D 和 E）。此外，與健康對照組相比，在 TCA 循環(huán)中的 ACO2、IDH、OGDH、DLD、SDH 和 MDH 等酶在 COVID-19 感染患者中較低，而對脂肪酸合成至關重要的酶（乙酰輔酶 A 羧化酶 [ACAC ] 和脂肪酸合成酶 [FASN]) 升高。與健康對照相比，在患者中可以觀察到血漿乳酸和 LDH 的顯著同時升高（圖 6E）。這些數(shù)據(jù)揭示了 SARS-CoV-2 感染期間脂蛋白代謝、糖酵解和 TCA 循環(huán)的失調。
圖6. COVID-19患者血漿代謝組差異
5. 病毒載量與嚴重 COVID-19 感染患者的疾病預后相關
COVID-19 的嚴重程度和臨床結果也與病毒載量有關�？傮w而言，與存活者相比，入院時 5 例死亡病例咽拭子中的 SARS-CoV-2 RNA 載量顯著更高（圖 7A）。參與抗病毒過程的蛋白質，包括 TCR 和 BCR 信號通路，與重癥幸存者的病毒載量變化呈正相關。此外，參與病毒生命周期過程的蛋白質，包括病毒mRNA 合成和先天免疫反應，僅與重癥致死組的病毒載量變化呈正相關（圖 7E）。值得注意的是，重癥存活組中涉及線粒體功能、脂質代謝過程、類固醇激素過程和 TCA 循環(huán)等途徑的蛋白質（例如，FASN、ACSS2、CPT1A、HADHB）持續(xù)上調（圖 7B和 C）。然而，這種上調僅在重癥致死組入院后的早期階段觀察到。令人驚訝的是，與病毒生命周期、病毒 RNA 合成和氧化應激相關的蛋白質（例如，EIF、EIFB、RPL19、SLCA24）在入院后的幾個幸存者病例中下調，但在死亡患者中保持高水平（圖 7B 和 D )。因此，SARS-CoV-2 可能會在感染期間利用宿主資源。
圖7. COVID-19重癥患者預后對比分析
6. 預測 COVID-19 感染患者臨床結果的生物標志物
由于發(fā)現(xiàn)了許多與 COVID-19 病理生理學相關的分子表型，研究者利用第一時間點或所有時間點的 exRNA、mRNA、蛋白質組學數(shù)據(jù)和相應的臨床協(xié)變量數(shù)據(jù)集，構建預測模型。PCA聚集成三種臨床表型：（i）健康組；(ii) 感染患者且預后良好；(iii)感染患者且預后較差（圖 8A）�；谒兴姆N類型數(shù)據(jù)的預測模型運行良好，表明入院時收集的所有四種類型的數(shù)據(jù)都包含關鍵的預后信息。
此外，研究者從四種類型的數(shù)據(jù)中各自確定了穩(wěn)健的預測模型和生物標志物。每個數(shù)據(jù)集中的一兩個特征（表達的基因、蛋白質、exRNA 和生化參數(shù)）能夠清楚地將患者分為具有不同預后特征的兩組（圖 8D-I）。預后不良與 D-二聚體和纖維蛋白原降解產(chǎn)物水平升高以及 F13A1 表達降低有關（圖 8H 和 I)，表明凝血狀態(tài)可能是監(jiān)測 COVID-19 進展的關鍵因素之一�；� mRNA 的模型顯示不良預后與較低水平的 CD3E 和較高水平的 OLAH 相關，因此與 COVID-19 感染患者的免疫反應高度一致（圖 8E）。此外，基于 exRNA 的預測因子包括 let-7 家族的成員（圖 8D 和 E）。最后，基于蛋白質的模型突出了富含細胞外外泌體、脂蛋白代謝過程、先天免疫反應和血液凝固的特征（圖8G 和 H）。
圖8. COVID-19患者預后預測模型
COVID-19 的嚴重程度和臨床結果與多器官損傷顯著相關。由于 ACE2廣泛存在，SARS-CoV -2 能夠感染許多器官。除了肺炎，多項臨床研究報告了住院 COVID-19 感染患者的輕度胃腸道、心血管癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)。組織病理學調查和尸檢也記錄了除肺以外的其他器官的損傷。
SARS-CoV-2 感染會導致患者發(fā)生急性肺損傷 (ALI)，本研究數(shù)據(jù)顯示，重癥患者的 AT1 和 AT2 細胞數(shù)量顯著減少，表明肺泡上皮遭到破壞，進而導致肺泡液積聚，進而引發(fā)缺氧；此外， HIF1a 信號改變，這可能會進一步惡化 ALI。因此，去除多余的肺泡液和恢復肺泡結構將具有重要的臨床意義。
在另一方面，免疫病理生理學是一個極大影響 COVID-19 臨床結果的因素。本研究縱向分析提供的證據(jù)表明，T 細胞動員成功的輕度或重度癥狀患者迅速控制了病情。相比之下，未能產(chǎn)生良好 T 細胞反應的重癥患者保持持續(xù)的促炎反應，并遭受細胞因子風暴和過量的 NETs。
值得注意的是，與輕度和重度存活患者相比，p38信號，膠原酶（MMP9），嗜中性粒細胞化學-引誘（CXCL2和CXCL6）和S100A8這些炎癥分子在重度致死患者中顯著上調，前者也表現(xiàn)出 I 型干擾素反應的持續(xù)升高�？傊�，在非常嚴重的 COVID-19 病例中，自身炎癥可能會放大疾病。缺乏來自其他呼吸道病原體的控制可能是這項研究的局限性，因此無法確信這些分子改變是否是COVID-19獨有，SARS-CoV-2 的病理學和病理生理學及其與其他呼吸道病原體的差異值得進一步研究。
在這項研究中，在 COVID-19 開始階段發(fā)現(xiàn)的一些分子與經(jīng)典血液和生化參數(shù)顯著相關，更重要的是與疾病嚴重程度相關。研究者分別建立了對于exRNAs、mRNA、蛋白質和生化參數(shù)的預測模型。在每種數(shù)據(jù)類型中僅使用一兩個生物標志物就可以準確預測 COVID-19 的臨床結果。此外，這些生物標志物可能具有與 COVID-19 病理生理學直接相關的生物學功能。例如，來自 exRNAs 的 let-7 家族、來自 mRNA 的 OLAH 和 CD3E 以及來自蛋白質組的 C4A 和 C4B 一致地揭示了 T 細胞活化和抑制炎癥反應的重要性。然而，由于這里使用的患者樣本量相對較小，顯然需要做更多的工作來確認這些生物標志物的可靠性和實用性，尤其是在更大的隊列中驗證這些生物標志物的預測能力。
文章轉自微信公眾號iMetabolome
