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文獻分享丨JPR血清還是血漿？

血樣的采集具有低侵襲性，且含有豐富的生物信息等優(yōu)點，是代謝組學(xué)臨床研究的首選生物體液。然而，采血管的選擇對血漿和血清代謝物的準(zhǔn)確定量有不可否認(rèn)的影響。來自意大利佛羅倫薩大學(xué)的Claudio Luchina團隊進行了相應(yīng)的比較，結(jié)果于2022年3月份發(fā)表在Journal of Proteome Research雜志上，文章標(biāo)題為“Serum or Plasma (and Which Plasma), That Is the Question”。

實驗采集了同一時間、同一地點，使用不同的血樣收集管，包括檸檬酸血漿、EDTA血漿和血清管，收集了6名健康志愿者（4名女性和2名男性）在短時間內(nèi)的多個血液樣本，并使用核磁共振波譜法比較了其代謝組學(xué)和脂蛋白譜。結(jié)果顯示，幾種代謝物在三種血液基質(zhì)之間有統(tǒng)計學(xué)意義的變化，代謝物的相關(guān)性也受到影響；不同采血管對脂蛋白譜的影響也很相關(guān)，但不那么明顯。解決由不同采血管造成的問題，對于在基于多中心多隊列樣本的流行病學(xué)研究水平上的代謝組學(xué)和脂蛋白分析至關(guān)重要。為此，作者提出了一種基于回歸的統(tǒng)計學(xué)解決方案，該方案可有效地減少由不同收集管引起的代謝組學(xué)和脂蛋白譜的改變。

簡介

血液常處理為血漿和血清的形式，且是一般臨床研究的首選生物流體，特別是在代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)方面。血液采集時侵入性低，生物信息豐富。血液衍生物包含不同組織對各種生理刺激、條件或應(yīng)激源所分泌的代謝物和脂蛋白。因此，血清和血漿對健康或疾病條件、遺傳變異、環(huán)境因素、生活方式、營養(yǎng)習(xí)慣和藥物都很敏感，它們可以在系統(tǒng)水平上提供重要的信息。由于所有的這些原因，血液衍生物經(jīng)常被收集，以供未來的科學(xué)研究使用。然而，由于分析前階段對人的代謝組/脂蛋白質(zhì)譜的穩(wěn)定性和組成有較大影響，只有合理采集和儲存的血清或血漿樣本才能代表真實且重要的健康資源。

了解不同血液形式的使用是否影響代謝組和脂蛋白譜對于在流行病學(xué)水平上成功解釋代謝組學(xué)和脂蛋白譜研究至關(guān)重要。目前，已有研究調(diào)查了與使用各種采血管相關(guān)的代謝組學(xué)特征的差異，但大多數(shù)研究集中在EDTA血漿，肝素血漿和血清之間的差異。但不同的血液收集管對脂質(zhì)組和/或脂蛋白譜的影響尚未探索。在本研究中，作者試圖通過使用三種不同的血液收集管 (檸檬酸鹽血漿管，EDTA血漿管和血清管) 來深入描述基于NMR的代謝組學(xué)和脂蛋白譜特征 (圖1)。此外，作者還提出了一種統(tǒng)計方法來克服不同血液衍生物之間存在的差異。

研究結(jié)果

作者使用3種不同的采血管（EDTA血漿、檸檬酸鹽血漿和血清管）收集了來自4名健康女性和2名健康男性，共23份血樣（如圖1），并將所有的血樣使用配備有控溫功能的自動進樣器（SampleJet）的600MHz核磁共振譜儀在310K的溫度下進行檢測，共測出24種小分子代謝物、2種糖蛋白和112種脂蛋白。

1 不同采血管對代謝物的影響

PCA顯示代謝物（圖 2A）和脂蛋白譜（圖 2B）在使用不同的采血管時都有清晰的聚類，表明不同的真空采血管時，代謝物水平和脂蛋白含量均會發(fā)生相對的失調(diào)。單變量分析發(fā)現(xiàn)24種小分子代謝物中的18種代謝物在檸檬酸鹽血漿、EDTA 血漿和血清中表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異。

一般來說，血清樣品中的氨基酸水平往往高于另兩種血漿樣品。造成這樣的結(jié)果可能是由于：1）這兩種抗凝劑對血漿蛋白水解活性都有部分抑制作用；2）在采集血清樣本的凝血步驟中，一些代謝物可能被活化的血小板釋放，從而增加了它們的含量。

在血清中，觀察到較兩種血漿樣本更高的乳酸水平以及降低的丙酮酸水平。這種現(xiàn)象已初步歸因于在血清與血細(xì)胞分離之前即凝血時間內(nèi)的持續(xù)糖酵解。丙酮、乙酸和甲酸也顯示在血清樣品中減少，這與之前的研究結(jié)果一致。有研究報道，乙酸和甲酸作為污染物存在于 EDTA 等離子管中。關(guān)于丙酮，研究人員提出這是由于在血液等分階段引入的污染。然而，本文作者懷疑丙酮、乙酸和甲酸可能是從塑料中釋放出來或存在于檸檬酸鹽血漿采集管的抗凝溶液中。

此外，作者還觀察到與血清相比，檸檬酸鹽血漿中的肌酐水平降低。與檸檬酸鹽血漿相比，EDTA 血漿樣品顯示出更高水平的三甲胺-N-氧化物和肌氨酸。此外，二甲基砜在所分析的所有三個采血管中顯示出顯著差異。檸檬酸鹽血漿、EDTA 血漿和血清的相關(guān)分析中指出了幾個統(tǒng)計學(xué)顯著差異的代謝物。琥珀酸、乙酰乙酸和 3-羥基丁酸在兩種血漿樣品中都高度相關(guān)，而這些關(guān)系在血清樣品中部分丟失。亮氨酸與檸檬酸鹽血漿中的 3-羥基丁酸鹽顯著抗相關(guān)，而 EDTA 血漿和血清中不存在相關(guān)性。谷氨酰胺、甘氨酸和組氨酸在血清中呈強正相關(guān)；然而，它們在兩個血漿樣本中都部分丟失了。

作者還檢查了糖蛋白區(qū)域的積分，與 EDTA 血漿和血清樣品相比，檸檬酸鹽血漿樣品中的 GlycA 和 GlycB 均顯示顯著降低。此外，與血清樣品相比，EDTA 血漿中的 GlycA 也呈現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低。 GlycA 和 GlycB 是與炎癥密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，可預(yù)測心血管事件；因此，當(dāng)需要測量這些糖蛋白時，應(yīng)該考慮上述現(xiàn)象造成的影響。

2 不同采血管對脂蛋白譜的影響

PCA顯示脂蛋白的分布（圖 2B）也受到采血管的影響，但血液樣本的清晰聚類（如代謝物（圖 2A））是不可見的，這意味著脂蛋白分布的變化不如代謝組學(xué)特征變化的那么明顯。其中，9 個樣本（3 個檸檬酸鹽血漿、3 個 EDTA 血漿和 3 個血清樣本）顯示為異常值：檸檬酸鹽血漿、EDTA 血漿和血清樣本（在基線和 2 周后收集）的兩個三聯(lián)體來自 5 號供體（圖 4 ，藍色球體），顯示出高水平的幾個 VLDL 脂蛋白相關(guān)參數(shù)和低水平的幾個 HDL 相關(guān)參數(shù)。另一組樣品（圖 4，洋紅色球體）與 6 號供體的基線樣品相關(guān)，其呈現(xiàn)特別高水平的 LDL 膽固醇相關(guān)參數(shù)。值得注意的是，兩位捐贈者都是男性。
從單變量分析中可以看出，與 EDTA 血漿和血清樣品相比，檸檬酸鹽血漿樣品的脂蛋白水平通常降低（圖 3）。與血清樣本相比，檸檬酸鹽血漿中 112 個脂蛋白相關(guān)參數(shù)中的 46 個顯著降低，5 個參數(shù)顯著增加（甘油三酯 LDL-3、VLDL-5膽固醇、VLDL-5游離膽固醇、VLDL-5磷脂、VLDL-5甘油三酯）。在這 51 項脂蛋白相關(guān)參數(shù)中，有 42 項在檸檬酸鹽和 EDTA 血漿之間的比較中也顯示出顯著變化；此外，與檸檬酸鹽血漿樣品相比，EDTA 樣品中的其他六個組分（LDL-4、LDL-4膽固醇、LDL-5膽固醇、LDL-4游離膽固醇、LDL5磷脂、LDL-4 Apo-B）顯著升高。相反，與血清樣本相比，EDTA 血漿樣本僅降低了 5 個脂蛋白相關(guān)參數(shù)（LDL-2游離膽固醇、HDL-1膽固醇、HDL-1游離膽固醇、HDL-1磷脂、HDL-1 Apo-A1）。

3 通過統(tǒng)計方法減少血清與血漿的差異

在代謝組學(xué)和脂蛋白譜研究中必須對不同的血液基質(zhì)進行統(tǒng)計分析時，因不同采血管造成的影響變得至關(guān)重要。作者通過分析殘差矩陣，通過指示收集管的分類變量（分類“檸檬酸鹽血漿”編碼為值1，“EDTA血漿”編碼為值2，“血清”編碼為值3）與代謝物或脂蛋白濃度的連續(xù)變量之間的回歸來解決。此方法可以有效地減少不同收集管對代謝產(chǎn)物和脂蛋白譜的 PCA 空間分離(圖 4A和B) : 在原始的 PCAs 中，三組代謝產(chǎn)物和脂蛋白的Calinski-Harabasz 指數(shù)（CH越大代表著聚類越緊密，類與類之間越分散）分別為16.1和1.4，在殘差計算的 PCAs 中，CH 值分別下降到4.9 × 10-32和1.5 × 10-31。通過血樣個體來源的PCA可以觀察到每個受試者聚集在她/他的 PCA 子空間中（圖 4C，D）。因此，作者假設(shè)，盡管此方法引起了原始數(shù)據(jù)的強烈變化，但它們的生物學(xué)和生理特性是保守的。

全文總結(jié)

采血基質(zhì)的選擇對于從代謝組學(xué)和脂蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)中獲得有意義的生物學(xué)推斷至關(guān)重要。本文的數(shù)據(jù)強調(diào)了使用不同的采血管時發(fā)生的變化和生化反應(yīng)是不同的。血漿和血清樣本不僅在抗凝劑的核磁共振峰上有所不同，而且大多數(shù)代謝物在不同基質(zhì)中的相關(guān)關(guān)系也不同。脂蛋白譜中也存在一些差異。因此，在規(guī)劃前瞻性研究時，應(yīng)避免使用不同的采集管，即使是在相同的血液基質(zhì)中，當(dāng)使用不同的采集管從不同中心采集樣本時，應(yīng)在多中心或回顧性研究中仔細(xì)考慮。

以上文章轉(zhuǎn)自iMtabolome公眾號，作者王琪。