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重磅綜述丨Phenomics阿爾茨海默癥進(jìn)展
《表型組學(xué)》（Phenomics）以封面論文在線發(fā)表了美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校李靈軍教授課題組題為Recent Advances in Understanding of Alzheimer’s Disease Progression Through Mass Spectrometry-Based Metabolomics的綜述文章。論文DOI鏈接：https://doi.org/10.1007/s43657-021-00036-9。
阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是老年人群出現(xiàn)癡呆的主要原因，它給國(guó)家和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)的負(fù)擔(dān)越來(lái)越重。因此，阿爾茨海默癥早期診斷尤為重要，其最大挑戰(zhàn)在于在更嚴(yán)重的、不可逆的癥狀出現(xiàn)之前診斷出處于臨床前階段的個(gè)體。
篩選生物標(biāo)志物對(duì)于準(zhǔn)確診斷阿爾茨海默癥患者至關(guān)重要。一個(gè)可靠的生物標(biāo)志物必須顯示出可測(cè)量的變化，協(xié)助區(qū)分健康人和患者。當(dāng)然，最好能在疾病進(jìn)展的輕度認(rèn)知障礙（mild cognitive impairment, MCI）階段就區(qū)分出健康人與阿爾茨海默癥患者。傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)通常來(lái)源于蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)組學(xué)）或基因（基因組學(xué)）研究，而代謝組研究可以揭示患者表型，包括遺傳因素和環(huán)境影響。由于代謝組學(xué)可以測(cè)量特定時(shí)間存在的代謝物，故能揭示患者隨時(shí)間變化的生理狀態(tài)及其對(duì)特定刺激的動(dòng)態(tài)反應(yīng)。
很顯然，患者的腦組織不是生物標(biāo)志物篩選的可行樣本來(lái)源；因此，早期研究使用死后的腦組織作為阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物來(lái)源；現(xiàn)在，研究者們開始轉(zhuǎn)向關(guān)注循環(huán)體液中的潛在樣本對(duì)象。質(zhì)譜（MS）是一種強(qiáng)大的、無(wú)標(biāo)簽的技術(shù)，可用于代謝物的鑒定和定量。該篇綜述討論了基于質(zhì)譜（MS）的阿爾茨海默癥代謝組學(xué)研究，包括樣品類型和制備、質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集策略和數(shù)據(jù)分析以及從研究中獲得的生物學(xué)見(jiàn)解，希望為未來(lái)的阿爾茨海默癥代謝組學(xué)研究提供參考。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
患者篩選
患者招募和選擇對(duì)任何疾病的研究都是至關(guān)重要的，但由于阿爾茨海默癥在患者死后才能明確診斷，因此，阿爾茨海默癥研究的患者選擇存在不確定性。在該綜述中，所提及的多項(xiàng)研究所采用的阿爾茨海默癥診斷標(biāo)準(zhǔn)各不相同，例如美國(guó)國(guó)家老齡化研究所-阿爾茨海默氏癥協(xié)會(huì)（NIA-AA）的標(biāo)準(zhǔn)、美國(guó)國(guó)家神經(jīng)和交際障礙疾病及中風(fēng)研究所和阿爾茨海默氏癥及相關(guān)疾病協(xié)會(huì)（NINCDS-ADRDA）頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)以及《精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第四版（DSM-IV）所采用的不同標(biāo)準(zhǔn)等。
其中，NIA-AA標(biāo)準(zhǔn)承認(rèn)使用生物標(biāo)志物作為診斷手段的潛力，該標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)可的阿爾茨海默癥診斷生物標(biāo)志物包括成像和生化生物標(biāo)志物，可分為三類：聚集的β-淀粉樣蛋白（Aβ）、聚集的tau（神經(jīng)纖維纏結(jié)）以及神經(jīng)退行/神經(jīng)元損傷（表1）。
樣本類型
阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物的代謝組學(xué)研究可以選擇多種不同類型的樣本。腦脊液（Cerebrospinal Fluid，CSF）是最廣泛使用的體液之一，但收集CSF是一個(gè)侵入性的過(guò)程且必須由醫(yī)生來(lái)完成，這使得難以將該體液用于大規(guī)模篩選。
此外，血漿也是阿爾茨海默癥研究的樣本來(lái)源之一。相對(duì)CSF采集，血漿獲取更便捷，且能相對(duì)準(zhǔn)確地代表整個(gè)身體系統(tǒng)。然而，由于血腦屏障的存在，血液代謝情況可能難以反映大腦的代謝情況。此外，一些研究表明，血漿代謝情況會(huì)因性別、年齡和種族等因素而異。目前，諸多研究將血漿與其他類型樣本結(jié)合使用（圖2）。血清和血漿密切相關(guān)，血清的整體代謝物濃度較高，但在不同樣本間的定量和重現(xiàn)性相比血漿較差。
尿液因其具有非侵入性、無(wú)菌且易收集的特點(diǎn)，也可作為生物標(biāo)志物的來(lái)源。但尿液主要含有親水性代謝物，其脂類和其他非極性代謝物的濃度較低；而脂質(zhì)代謝失調(diào)卻是阿爾茨海默癥研究關(guān)注內(nèi)容之一，因而尿液可能不是阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物的合適來(lái)源樣本。
唾液是最容易獲得的體液之一。但阿爾茨海默癥經(jīng)常導(dǎo)致患者唾液流量減少和口干，這使得很難收集到足夠的樣本進(jìn)行分析。
樣本收集與準(zhǔn)備
代謝組的樣本收集與準(zhǔn)備主要分為三個(gè)部分：空腹采樣、萃取和衍生化。
空腹采血是多種血液測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)做法，因?yàn)橄^(guò)程可能會(huì)提高某些代謝物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水平，如葡萄糖和甘油三酯。也有研究卻表明，空腹時(shí)一些代謝物的濃度與非空腹時(shí)的濃度沒(méi)有顯著差別。該綜述中有9項(xiàng)研究要求受試者在樣本采集前禁食，2項(xiàng)不要求禁食（樣本為血漿），另有4項(xiàng)沒(méi)有說(shuō)明。
萃取溶劑的選擇決定了哪些代謝物將被提取出來(lái)從而進(jìn)行分析。理想溶劑可以提取到所有的代謝物并將其降解到最小分子質(zhì)量。萃取一般可以分為兩類：?jiǎn)蜗噍腿『碗p相萃取。單相萃取法使用單一溶劑將代謝物萃取到一個(gè)相中，操作簡(jiǎn)單，有很大優(yōu)勢(shì)。該綜述包括了9項(xiàng)利用單相萃取的研究，其中7項(xiàng)使用了乙腈。此外，甲醇也常被用作單相萃取溶劑。雙相萃取法則利用溶劑組合將代謝物萃取到極性或非極性相中，溶劑組合通常為水加一種有機(jī)溶劑。雙相萃取可以獲得更高的代謝組覆蓋度，且雙相溶劑組合可利用互補(bǔ)分離的方法進(jìn)行代謝組研究。因此，雙相萃取法屬于國(guó)際代謝組研究中最常用的方法。當(dāng)然，雙相萃取也有一些缺點(diǎn)，即在處理許多雙相溶劑組合時(shí)，耗時(shí)長(zhǎng)且技術(shù)難度大。
分析物的化學(xué)衍生化對(duì)于進(jìn)一步檢測(cè)至關(guān)重要，通過(guò)衍生化可以改變代謝物的結(jié)構(gòu)、分子極性和大小。衍生化也可以用來(lái)穩(wěn)定待分析物分子，一般來(lái)說(shuō)，氣相色譜法（GC-MS）需要衍生化來(lái)增加待分析物的熱/化學(xué)穩(wěn)定性和揮發(fā)性。GC-MS中的衍生化也可以通過(guò)改變待分析物的分子特性（如極性）來(lái)提高分離效果。常用的衍生化包括硅烷化、肟化、烷基化和�；Ｔ摼C述中的大多數(shù)研究使用了無(wú)標(biāo)簽的方法，但實(shí)際上，同位素標(biāo)簽已被廣泛應(yīng)用在標(biāo)記官能團(tuán)、定量代謝物等方面。
質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集
質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的過(guò)程主要包括分子分離、電離、質(zhì)量分析。
該篇綜述中介紹了多種分離方法，包括反相液相色譜（RPLC）、親水作用色譜（HILIC）、LC-MS、GC-MS等。其中，RPLC能夠覆蓋人類代謝組的非極性和半極性部分，但極性代謝物在C18柱上的保留率很低，并且會(huì)因洗脫太快而無(wú)法分離和檢測(cè)。HILIC根據(jù)分子的親水性進(jìn)行分離，疏水性的代謝物會(huì)較早被洗脫，而親水性的、典型的極性代謝物被很好地保留。HILIC是對(duì)RPLC的補(bǔ)充，經(jīng)常被正交使用，以確保在非靶向?qū)嶒?yàn)中完全覆蓋阿爾茨海默癥代謝組（圖3）。
LC-MS、GC-MS也常被用在代謝組實(shí)驗(yàn)中，但不是所有的代謝物都能被揮發(fā)或熱穩(wěn)定到足以用于GC-MS。此外，毛細(xì)管電泳（CE）是一種極具成本效益的分離方法，它需要的樣品量很小，并且最適用于極性和帶電代謝物的分離，這使其成為RPLC的補(bǔ)充方法。離子遷移光譜-質(zhì)譜（IMS-MS）也是一種獨(dú)特的分離和識(shí)別代謝物的方法。上述所有的分離技術(shù)都是在電離前分離代謝物，而IMS-MS則是利用緩沖氣體來(lái)分離電離后的分子。
電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）因能廣泛覆蓋分子而成為代謝組學(xué)的首選技術(shù)。ESI在正極性（ESI+）和負(fù)極性（ESI-）模式下操作：容易被質(zhì)子化的分子（堿）在ESI+中更容易被檢測(cè)到，而可以去質(zhì)子化的分子（酸）在ESI-中更容易被檢測(cè)到。
代謝組的研究可分為靶向或非靶向兩大類，靶向的目的是對(duì)已經(jīng)確定分析物的特定代謝物進(jìn)行定量，而非靶向代謝組研究尋求更大的代謝組覆蓋率，并旨在通過(guò)高分辨率來(lái)區(qū)分具有相似質(zhì)量的分子。為了在質(zhì)量分辨率較低的情況下增加代謝物鑒定的可靠性，可以使用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）。該綜述中涉及的大多數(shù)研究都采用MS/MS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)方法
靶向代謝組學(xué)研究通常有一個(gè)較小的分析物范圍，這使得加入內(nèi)參便能實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。該綜述中包括的一些研究利用穩(wěn)定的同位素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行絕對(duì)定量，但大多數(shù)研究使用有質(zhì)控的相對(duì)定量和變化倍數(shù)計(jì)算。在靶向研究中針對(duì)大規(guī)模代謝物進(jìn)行量化的前景十分明朗，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（parallel reaction monitoring，PRM）等技術(shù)正力圖提供實(shí)現(xiàn)大規(guī)模靶向代謝組學(xué)量化的途徑。
數(shù)據(jù)預(yù)處理是代謝組學(xué)研究中的一個(gè)重要步驟，包括去卷積和特征檢測(cè)等步驟，還包括空白校正和歸一化等質(zhì)量控制步驟。盡管存在一些商業(yè)軟件包，如Compound Discoverer™和MetaboScape®，但這些僅適用于特定質(zhì)譜儀器的數(shù)據(jù)分析。目前逐漸流行的是將原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為與開源軟件包（如MS-DIAL、XCMS）兼容的開放格式。
在該綜述提及的研究中，根據(jù)其統(tǒng)計(jì)分析思路可分為兩類：將代謝物濃度與公認(rèn)的生物標(biāo)志物（如Aβ）相關(guān)聯(lián)，以及將代謝物濃度與是否存在阿爾茨海默癥癡呆癥狀相關(guān)聯(lián)。前者可能更有利于檢測(cè)到重要生物標(biāo)志物，因?yàn)榇x物濃度的變化可能更容易與淀粉樣蛋白聚集物的增加而不是感知到的認(rèn)知變化等相關(guān)（圖4）。
生物學(xué)見(jiàn)解
該綜述包括了15項(xiàng)不同的阿爾茨海默癥代謝組學(xué)研究，并且各自都使用了不同的體液樣本。通過(guò)比較從各種分離方法及質(zhì)譜技術(shù)中所得到的發(fā)現(xiàn)，可以確定研究結(jié)果的一致性如何。通過(guò)多種體液之間的比較，不僅可以顯示出多個(gè)系統(tǒng)之間的相似性，還可以闡明不同體液之間的關(guān)系。該綜述整合討論了這些研究數(shù)據(jù)，并對(duì)幾個(gè)重要的代謝途徑進(jìn)行了詳細(xì)分析。
能量代謝
研究發(fā)現(xiàn)在一些體液中能夠檢測(cè)到與能量有關(guān)的代謝物。該文總結(jié)了一些相關(guān)的關(guān)鍵特征：阿爾茨海默癥患者的大腦通常顯示出葡萄糖代謝水平明顯下降；阿爾茨海默癥患者的能量代謝失調(diào)還表現(xiàn)為胰島素抵抗和大腦中胰島素的低表達(dá)；山梨醇濃度的增加表明葡萄糖-山梨醇途徑在阿爾茨海默癥患者中可能被激活；3-羥基丁酸在阿爾茨海默癥患者尿液中持續(xù)減少等等。
氨基酸代謝
阿爾茨海默癥患者體內(nèi)，精氨酸在CSF和血漿中表達(dá)量減少，提示由于精氨酸酶和一氧化氮（NO）合成酶之間的相互作用，使得精氨酸酶的表達(dá)可能有所增加。一氧化氮是維持大腦功能的關(guān)鍵，可調(diào)節(jié)腦血流，并作為一種神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用。如果沒(méi)有精氨酸酶表達(dá)量的變化，精氨酸的減少也可歸因于精氨酸轉(zhuǎn)向代謝為胍基化合物。已知的許多胍基化合物具有神經(jīng)毒性，從而會(huì)增加氧化應(yīng)激反應(yīng)。
異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸是被稱為支鏈氨基酸（branched chain amino acids , BCAA）的三種必需氨基酸。該綜述所提及的研究中，與對(duì)照組相比，阿爾茨海默癥患者體內(nèi)三種BCAAs表達(dá)量均有所下降。體內(nèi)BCAAs濃度的降低可能導(dǎo)致谷氨酸的產(chǎn)生減少，導(dǎo)致大腦中谷氨酸能神經(jīng)元的損失。纈氨酸在楓糖尿病患者體內(nèi)的高濃度與細(xì)胞凋亡的增加有關(guān)。纈氨酸濃度降低可能是阿爾茨海默癥患者的身體對(duì)體內(nèi)細(xì)胞凋亡進(jìn)程增加所作出的反應(yīng)。
此外，血液中同型半胱氨酸的異常積累也與阿爾茨海默癥發(fā)展的高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。高同型半胱氨酸水平與區(qū)域性腦萎縮和血管病變有關(guān)，可能影響tau蛋白的磷酸化和膽堿酯酶的降解。
膽堿代謝
阿爾茨海默癥早期發(fā)展的病理事件包括基底前腦的膽堿能神經(jīng)元損失。乙酰膽堿是一種能夠參與膽堿能神經(jīng)元系統(tǒng)（包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和參與記憶的神經(jīng)元）活動(dòng)的基本神經(jīng)遞質(zhì)。
乙酰膽堿是由膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase, ChAT）產(chǎn)生的，這種酶在阿爾茨海默癥患者大腦中的活性明顯降低，其活性降低程度與認(rèn)知障礙的嚴(yán)重程度相關(guān)。多項(xiàng)研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默癥患者的膽堿濃度增加，這可能是由于ChAT的活性下降引起的。盡管目前尚無(wú)可逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默癥發(fā)展的藥物治療手段，膽堿酯酶抑制劑通常被用于暫時(shí)改善阿爾茨海默癥患者的一些認(rèn)知癥狀。
脂肪酸代謝
相關(guān)研究檢測(cè)到幾個(gè)與肉堿有關(guān)的代謝物出現(xiàn)了明顯的改變，表明阿爾茨海默癥患者的脂肪酸代謝發(fā)生紊亂。中鏈�；鈮A在阿爾茨海默癥患者血漿中明顯減少，并與衡量認(rèn)知表現(xiàn)的小型精神狀態(tài)檢查（mini-mental state examination, MMSE）得分有高度相關(guān)性。此外，研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默癥患者血漿中花生四烯酸的減少及其前體亞油酸的增加。亞油酸和花生四烯酸都被證明可以誘導(dǎo)tau和Aβ的聚合，這意味著它們可能關(guān)聯(lián)并甚至誘發(fā)了阿爾茨海默癥的一些病理變化。
總結(jié)與展望
阿爾茨海默癥是一種非常復(fù)雜的疾病，絕非僅由一種代謝功能紊亂所導(dǎo)致，本綜述中的研究闡述了阿爾茨海默癥的相關(guān)代謝紊亂，后續(xù)逐漸統(tǒng)一的阿爾茨海默癥相關(guān)研究將有利于探尋更加明確的受影響通路。
阿爾茨海默癥研究應(yīng)建立更加統(tǒng)一的患者隊(duì)列標(biāo)準(zhǔn)，并增加患者隊(duì)列的多樣性。此外，阿爾茨海默癥研究設(shè)計(jì)的一致性也應(yīng)該擴(kuò)展到相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法中。對(duì)于潛在的阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物而言，它需要持續(xù)失調(diào)并不斷地出現(xiàn)在阿爾茨海默癥代謝研究中。
文中討論的每種樣本類型都具有優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，而通過(guò)唾液和尿液的非侵入式的樣本收集對(duì)基于生物標(biāo)志物的阿爾茨海默癥診斷需謹(jǐn)慎考慮。盡管收集尿液或唾液可以減緩對(duì)患者的創(chuàng)傷，且具有很強(qiáng)的便利性，但因阿爾茨海默癥患者經(jīng)常出現(xiàn)神經(jīng)精神性癥狀和精神病性癥狀，應(yīng)用上述兩種方法仍需十分謹(jǐn)慎。盡管如此，任何可從患者輕松收集到的樣本都將大大減少患者和護(hù)理人員的壓力。
隨著更多研究的深入開展，可以配合使用許多潛在的代謝生物標(biāo)志物和與目前公認(rèn)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物相結(jié)合，以便在疾病的早期階段更加準(zhǔn)確地診斷阿爾茨海默癥。
Abstract
Alzheimer’s disease (AD) is the leading cause of dementia in the aging population, but despite extensive research, there is no consensus on the biological cause of AD. While AD research is dominated by protein/peptide-centric research based on the amyloid hypothesis, a theory that designates dysfunction in beta-amyloid production, accumulation, or disposal as the primary cause of AD, many studies focus on metabolomics as a means of understanding the biological processes behind AD progression. In this review, we discuss mass spectrometry (MS)-based AD metabolomics studies, including sample type and preparation, mass spectrometry data acquisition strategies, and data analysis, as well as biological insights gleaned from these studies, with the hope of informing future AD metabolomic studies.
作者簡(jiǎn)介
Lingjun Li（李靈軍）教授，2002年加入美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校，致力于生物分析科學(xué)以及質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)的研究，主要涉及的領(lǐng)域有神經(jīng)肽組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等，并應(yīng)用這些尖端的分析方法和技術(shù)去解決神經(jīng)生物學(xué)、基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)中的關(guān)鍵性問(wèn)題。
文章轉(zhuǎn)自微信公眾號(hào)人類表型組計(jì)劃。
