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經(jīng)典重讀丨Anal Chem脂蛋白亞類檢測新方法
脂蛋白根據(jù)密度大小可分為：乳糜微粒（CM）、極低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）。進一步超速離心，每一種脂蛋白還能分為不同亞類，但是各種亞類相關(guān)的功能性研究寥寥無己，這些亞類的定量檢測長久以來一直缺乏合適的方法。
2018年10月，英國帝國理工學(xué)院的Jeremy K. Nicholson團隊在Analytical Chemistry上發(fā)表了方法學(xué)文章“Quantitative Lipoprotein Subclass and Low Molecular Weight Metabolite Analysis in Human Serum and Plasma by 1 H NMR Spectroscopy in a Multilaboratory Trial”，提出了一種基于NMR的脂蛋白亞類檢測方法，可快速定量分析臨床血樣中105種脂蛋白亞類和24種小分子代謝物，并進行了方法學(xué)驗證。迄今為止，該方法在多種疾病模型（包括COVID-19）中得到了應(yīng)用，已被96篇文獻進行了引用（截止日期：2022.06.14，數(shù)據(jù)來源google學(xué)術(shù)）。
引言
脂蛋白（Lipoprotein）是在血液中運送水不溶性脂類的超分子組裝體（球狀微粒），由富含膽固醇酯、甘油三酯的疏水性內(nèi)核和由載脂蛋白、單層磷脂、膽固醇等組成的外殼構(gòu)成。載脂蛋白是構(gòu)成脂蛋白的蛋白質(zhì)組分，主要分A、B、C、D、E五類�；竟δ苁沁\載脂類物質(zhì)及穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)，某些載脂蛋白還有激活脂蛋白代謝酶、識別受體等功能。主要在肝（部分在小腸）合成，按ABC系統(tǒng)命名，每類又可細(xì)分幾個亞類，以羅馬數(shù)字表示。
其中VLDL可分為5個亞類（VLDL 1-5），LDL可分為6個亞類（LDL 1-6），HDL可分為4個亞類（HDL 1-4）。臨床上經(jīng)常使用的血脂檢測包括7項：總膽固醇（Cholesterols）、甘油三酯（Triglycerides）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、脂蛋白（a）、載脂蛋白A1（ApoA1）和載脂蛋白B（ApoB），檢測原理基于酶促反應(yīng)，僅需2分鐘。但是這樣得到的結(jié)果并不精準(zhǔn)，總膽固醇和HDL是檢測得到的，剩下的指標(biāo)如甘油三酯等都是通過計算得到的。此外，總膽固醇是不同種類脂蛋白上膽固醇的總量，也不區(qū)分游離膽固醇和固醇酯，其它指標(biāo)也存在類似問題。
定量檢測脂蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法是使用超速離心機按照密度差異進行物理分離，然而這種方法非常耗時（每個樣品要經(jīng)過兩步離心程序約24小時），也僅僅只能獲得4或5種主要的脂蛋白（CM，VLDL，LDL，HDL2和HDL3）。每一種脂蛋白的組成各不相同，要想了解其功能，需要對各種亞類進行深入分析。
定量檢測脂蛋白的另一種快速方法是使用1H NMR技術(shù)。由于脂蛋白這類大分子末端的-CH3和-CH2-會在NMR圖譜中形成一系列疊加的寬峰，它們互相之間細(xì)微的化學(xué)位移差別是由于脂質(zhì)和顆粒本身大小產(chǎn)生的。而這兩類信號峰可以通過線性擬合的方式區(qū)分來自VLDL、LDL、HDL和蛋白質(zhì)的貢獻。經(jīng)過不斷的技術(shù)發(fā)展，我們基于1H NMR的信號去卷積結(jié)合多變量統(tǒng)計構(gòu)建了模型，可以對臨床血樣中105種脂蛋白亞類和24種小分子代謝物進行定量檢測，方法在多中心進行了驗證，重復(fù)性和準(zhǔn)確性極高。
實驗過程
來自3個機構(gòu)的5個實驗室參與了本次研究，5個機構(gòu)分布在四個不同的地理位置，參與實驗的共有11臺設(shè)備，均為Bruker 600 MHz核磁共振波譜儀，均使用IVDr方法對樣品進行檢測。
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來自NIST的1951c（冷凍人血清中的脂類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）。
中心QC樣本來自37名健康志愿者（男19人，女18個），所有血樣先混合再等分20份/每中心，凍融次數(shù)一致，用于10天檢測期內(nèi)的質(zhì)量控制。
脂蛋白亞類檢測方法建立
使用Bruker商業(yè)化的IVDr方法（B.I.-LISA），先將基于PULCON方法的核磁譜圖歸一化為質(zhì)子濃度為mmol/L，再對數(shù)據(jù)進行均值中心化，化學(xué)位移較正使用TSP的甲基信號和丙氨酸雙峰的1.48 ppm信號。對化學(xué)位移為0.8 ppm（-CH3）和1.25 ppm（-CH2）的信號分別使用PLS-2回歸模型（使用兩個百人隊列建立）進行擬合，得到105種脂蛋白亞類濃度。
代謝物小分子檢測方法建立
使用內(nèi)部開發(fā)的基于圖形的Matlab算法實現(xiàn)，一維1H譜圖即可定量。
實驗結(jié)果
脂蛋白亞類方法精密度
1951c的甘油三酯、總膽固醇、LDL膽固醇、HDL膽固醇的濃度已知，將IVDr方法檢測得到的結(jié)果與之比較，兩者的相關(guān)度均高于0.90。檢測相對誤差低于13%，符合NECP的要求。
室內(nèi)室間重現(xiàn)性
方法具有極佳的重現(xiàn)性和精密度，均符合NECP的要求。
總結(jié)
臨床血清或血漿的脂蛋白亞類定量分析對于了解許多疾�。ㄖT如心血管疾病、代謝綜合征、神經(jīng)病理學(xué)和其它以脂質(zhì)謝紊亂為特征的疾�。┑陌l(fā)病機制是必要而重要的。我們評估了一種同時檢測血樣中105種脂蛋白亞類、12種比值和24種小分子代謝物的方法，結(jié)果可在11臺核磁共振波譜儀上得到重現(xiàn)，總誤差范圍在3.4%~10.5%之間（NCEP可接受的范圍是8.9%~15%），準(zhǔn)確度極高，方法重現(xiàn)性也滿足相應(yīng)要求。這些數(shù)據(jù)表明，只要按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進行檢測，不同實驗室的結(jié)果的可靠性均能得到保證。
