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文獻(xiàn)分享丨Nat Protoc代謝組學(xué)非靶流程
代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新興發(fā)展起來的學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。代謝組學(xué)的概念來源于代謝組，代謝組是指某一生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有的小分子代謝產(chǎn)物，代謝組學(xué)則是對某一生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有小分子代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析。色譜-質(zhì)譜平臺經(jīng)常用于對單個(gè)生物液體或組織樣本中的數(shù)百至數(shù)千種代謝物進(jìn)行高靈敏且可重復(fù)的檢測。
英國曼徹斯特大學(xué)Royston Goodacre團(tuán)隊(duì)聯(lián)合人類血清代謝組學(xué)聯(lián)合會（HUSERMET）對基于質(zhì)譜技術(shù)的大規(guī)模血清/血漿代謝組學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行了詳細(xì)描述，相關(guān)研究成果于2011年7月發(fā)表于Nature Protocols，文章標(biāo)題“Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry”。原文鏈接：https://doi.org/10.1038/nprot.2011.335。
代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)研究的核心組成，主要是對小分子量有機(jī)和無機(jī)（<1500 Da）代謝產(chǎn)物的整體研究。與其他“組學(xué)”平臺（例如轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)）相比，代謝物分析能夠以高通量方法和較低的總成本對大樣本集進(jìn)行全局篩選。代謝組學(xué)分析平臺包括氣相色譜（GC）或液相色譜（LC/UPLC）聯(lián)用質(zhì)譜（MS）、毛細(xì)管電泳、核磁共振光譜、紅外和拉曼光譜、電化學(xué)檢測器，或直接使用MS等檢測。由于哺乳動物代謝組的復(fù)雜性，沒有一個(gè)單獨(dú)的分析平臺可以用于檢測生物樣本中的所有代謝物，必須使用多個(gè)分析平臺來提高檢測代謝物的覆蓋率。GC-MS或UPLC-MS由于高通量、高精密度及低成本而廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究。
血清/血漿的大規(guī)模代謝組學(xué)研究
在臨床代謝組學(xué)研究中，涉及的樣本包括血液（血清、血漿）、尿液、腦脊液、淋巴液、膽汁、糞便、唾液、細(xì)胞、組織等，其中血液（血清、血漿）是研究最多的樣本。血液在生物體內(nèi)有著廣泛的流動性，起著最重要的物質(zhì)傳輸作用，包含數(shù)百或數(shù)千種代謝物，可以反應(yīng)生物體最直接、最有效代謝情況。
人類的代謝表型受到了遺傳因素和環(huán)境（飲食、年齡、生活方式、性別等因素）的影響。為準(zhǔn)確有效地定義其代謝變化，需要大樣本量的流行病學(xué)調(diào)查，可能涉及數(shù)千個(gè)樣本（比如隊(duì)列研究）。核磁共振方法由于重現(xiàn)性極高，樣品不與儀器直接接觸，具有非破壞性的優(yōu)點(diǎn)，容易實(shí)現(xiàn)對數(shù)百到數(shù)千個(gè)樣本的高通量分析。對于色譜-質(zhì)譜平臺來說，由于樣品注入到分析器中，會污染儀器，存在響應(yīng)差異和保留時(shí)間漂移，諸多因素限制了高分辨質(zhì)譜的通量。因此，基于色譜-質(zhì)譜平臺，進(jìn)行大規(guī)模代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須使用代表性質(zhì)控樣本（QC），保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定及可重復(fù)性。代謝組學(xué)大規(guī)模研究中的通用工作流程包括：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣品制備、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集成/數(shù)據(jù)分析。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
在實(shí)際研究中，代謝物易受各種因素影響。代謝組學(xué)的研究從小規(guī)模擴(kuò)展到大規(guī)模，即從單次分析樣本少于100個(gè)的生物實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展到數(shù)月或數(shù)年內(nèi)分析數(shù)千個(gè)樣本。規(guī)模擴(kuò)大后需要合理選擇參與者（研究設(shè)計(jì)）、生物樣本的收集、分析實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)），以使后續(xù)的數(shù)據(jù)分析無偏向且符合目的。
在大規(guī)模的隊(duì)列研究中，由于色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)中，代謝特征（儀器信號響應(yīng)）會隨著時(shí)間變化，因此，在整個(gè)分析過程中定期分析QC樣品，以便為檢測到的每個(gè)代謝特征提供可靠的質(zhì)量保證（QA）。在后期數(shù)據(jù)處理階段，可以通過QC校正每個(gè)樣本的代謝信號，并在數(shù)據(jù)采集后和統(tǒng)計(jì)分析前將批量數(shù)據(jù)合并在一起。
1）樣本收集與保存：血清是不加抗凝劑通過凝血和離心除去血細(xì)胞和纖維蛋白原后分離得到的上清，而血漿是從全血中通過加入抗凝劑后離心分離得到的。關(guān)于抗凝劑選擇，檸檬酸鹽和EDTA都可能引入干擾峰或抑制內(nèi)源性分析物而影響代謝譜，因此，在收集血漿樣品時(shí)首選肝素鋰。制備血清和血漿后，分裝儲存在-80℃，避免反復(fù)凍融。
2）GC-MS應(yīng)用：主要用于分析揮發(fā)性化合物或可以通過衍生化轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)性的化合物。GC主要可以實(shí)現(xiàn)分子量范圍為18-350 Da的代謝物分離，包括氨基酸、有機(jī)酸、胺、酰胺和糖等。GC-MS代謝分析常用的質(zhì)譜儀為飛行時(shí)間（TOF）和四極桿質(zhì)譜。樣品在GC中的保留時(shí)間（常用保留指數(shù)）與經(jīng)質(zhì)譜EI離子源產(chǎn)生的特征碎片，可以幫助比對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物鑒定。血清和血漿中發(fā)現(xiàn)的許多代謝物在GC-MS分析之前需要衍生，常用的衍生化方法是三甲基硅烷化（TMS）。
3）UPLC-MS應(yīng)用：UPLC是超高效液相色譜，具有高分離度和高靈敏度等，常與TOF或傅立葉變換/軌道質(zhì)譜儀聯(lián)用。UPLC-MS的線性動態(tài)范圍超過三到五個(gè)數(shù)量級，可以檢測到濃度低于最高濃度0.01%的代謝物。常用的色譜分離法為反相色譜法，溶劑通常為甲醇或乙腈。質(zhì)譜常用的離子源為電噴霧離子源（ESI），為提高代謝物覆蓋率，一般進(jìn)樣時(shí)采用兩種模式，正離子模式（ESI+）和負(fù)離子模式（ESI-）。UPLC-MS可以檢測的代謝物較為廣泛，包括大分子量范圍（50~1500Da）代謝物，如高分子量脂質(zhì)（如磷脂和甘油三酯）和非極性氨基酸。與GC-MS相比，UPLC-MS的樣品制備較簡單，不需要衍生，常用蛋白沉淀法。
4）血清/血漿樣本的選擇：血清和血漿中的代謝物種類差異不大，但并不完全相同。血漿和血清從血液中去除細(xì)胞的方法將導(dǎo)致產(chǎn)生的液體成分略有不同。血漿或血清的選擇一般基于環(huán)境、設(shè)施及個(gè)人偏好。鑒于血漿和血清之間的樣本成分可能存在差異，應(yīng)注意確保在任何特定研究中僅使用一種樣本類型。
血清/血漿樣本前處理
血清或血漿樣本中包括小分子代謝物和其他高分子量物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)和RNA），基質(zhì)較復(fù)雜。基于GC/UPLC-MS研究的血清和血漿樣品，需要經(jīng)過前處理后才可進(jìn)樣分析。常用的方法為蛋白沉淀，即添加有機(jī)溶劑或溶劑混合物以沉淀蛋白質(zhì)等高分子量物質(zhì)，然后通過離心分離沉淀物和含有代謝物的上清液。常用的沉淀劑為甲醇，比例為3:1（體積/體積）時(shí)可高效去除蛋白質(zhì)，且步驟簡單。此外，因血清和血漿含有高水平的酶，為抑制酶活性，減少對代謝物的影響，蛋白質(zhì)沉淀時(shí)應(yīng)使用冰溶劑或步驟在冰上進(jìn)行。與UPLC-MS相比，用于GC-MS進(jìn)樣分析的前處理需要衍生化，步驟較多，且進(jìn)樣體積�。ㄍǔ�1µl），容易產(chǎn)生誤差。通常在所有樣品中加入一個(gè)或多個(gè)內(nèi)標(biāo)物，用于校正樣品處理和進(jìn)樣時(shí)的誤差。
樣本分析（數(shù)據(jù)采集）
如上所述，基于GC/UPLC-MS的樣本量較小的實(shí)驗(yàn)，可獲得重復(fù)且穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，通過質(zhì)量保證程序處理多個(gè)小規(guī)模的分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，整合成為大規(guī)模代謝組實(shí)驗(yàn)。作者通過對GC-MS和UPLC-MS方法優(yōu)化和驗(yàn)證后，單個(gè)分析實(shí)驗(yàn)的樣本量宜為120個(gè)樣本。此外，在GC-MS和UPLC-M的每個(gè)分析批次結(jié)束時(shí)需進(jìn)行儀器維護(hù)，包括質(zhì)譜儀離子源和色譜柱清洗等。
在大規(guī)模血清樣本分析時(shí)，QC樣本的選擇及穩(wěn)定可保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確。QC樣本需與樣本種類保持一致，其代謝和基質(zhì)組成與研究中的生物樣品相似。一般有兩種QC樣品，一種是混合QC，是將待研究的每個(gè)生物樣品的一部分混合后制備，一種是商業(yè)QC樣本�；旌螿C最接近研究樣本，適合樣本量較小的實(shí)驗(yàn)研究，但是不適用大規(guī)模研究。作者在血清大規(guī)模分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)商用血清QC與研究樣本之間存在代謝物及其相對濃度不同的情況，會丟失部分代謝信息。因此，作者建議使用來自所有受試者群體或受試者群體子集的混合QC樣本，以確保最小程度的代謝信息丟失。
使用QC樣品的原因，首先是在分析樣本前可用QC平衡儀器響應(yīng)、分析方法，以確保獲得可再現(xiàn)的數(shù)據(jù)；其次是用QC提供分析數(shù)據(jù)來計(jì)算每個(gè)分析區(qū)塊內(nèi)的技術(shù)精度，即QA程序。對于UPLC-MS，分析時(shí)三分之二的質(zhì)控樣品中檢測到的代謝物響應(yīng)在質(zhì)控平均值的20%以內(nèi)，而對GC-MS，30%也可接受；第三個(gè)原因是使用QC樣本來校正分析批次內(nèi)及批次間的信號校正�？刹捎帽镜厣Ⅻc(diǎn)平滑估計(jì)（Locally Estimated Scatterplot Smoothing，LOESS）方法用QC進(jìn)行信號校正（QC-RLSC）。即通過QC樣本中相同代謝特征的信號變化，來校正周圍研究樣本中每個(gè)代謝特征的信號漂移。為使信號校正準(zhǔn)確，要求在每3-5個(gè)樣本中插入QC樣本。
數(shù)據(jù)處理
使用GC-MS和UPLC-MS采集的原始數(shù)據(jù)通常需經(jīng)過預(yù)處理，以適當(dāng)?shù)母袷教峁┙Y(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)用于數(shù)據(jù)分析。使用一系列軟件處理這些數(shù)據(jù)，以構(gòu)建色譜峰（具有相關(guān)保留時(shí)間或指數(shù)、EI碎片質(zhì)譜和/或準(zhǔn)確質(zhì)量）、峰值響應(yīng)與對應(yīng)樣品的矩陣。這數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化可在儀器公司自建軟件中進(jìn)行，如Waters MarkerLynx、ThermoFisher SIEVE、Agilent MasshHunter、Applied Biosystems MarkerView、Shimadzu Profiler AM+和LECO ChromaTOF，或在一些開源和免費(fèi)軟件（如XCMS89、MZmine90、Metalign91和MathDAMP92）中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
質(zhì)量控制
在使用GC-MS和UPLC-MS分析時(shí)，信號強(qiáng)度隨時(shí)間漂移的問題是長期代謝組學(xué)研究中的一個(gè)挑戰(zhàn)。在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，色譜反卷積處理后，需要使用QC-RLSC將每個(gè)檢測到的代謝特征歸一化。使用QC樣本進(jìn)行QA、信號校正和數(shù)據(jù)集成的數(shù)據(jù)預(yù)處理工作流程如下圖所示。詳細(xì)的方法可以參考原文。
代謝物鑒定
代謝組學(xué)非靶分析中，代謝產(chǎn)物鑒定是最大的難題。目前，在色譜質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集中，由于鑒定的數(shù)據(jù)庫還不完善，還存在很多未識別的色譜峰。人體代謝組由內(nèi)源代謝產(chǎn)物、外源代謝產(chǎn)物（例如藥物、食物成分、植物化學(xué)物質(zhì)）、內(nèi)源和外源代謝產(chǎn)物的代謝產(chǎn)物以及來自腸道菌群的代謝產(chǎn)物組成，而并非所有已知的代謝物都可以購買來構(gòu)建質(zhì)譜庫以幫助識別。一般代謝物的鑒定包括以下方法：
1）推定鑒定，將代謝特征的單個(gè)參數(shù)（如準(zhǔn)確的質(zhì)量或質(zhì)譜碎片）與數(shù)據(jù)庫中的代謝物進(jìn)行匹配，置信度較低。
2）最終鑒定，在相同分析條件下，比對樣品中存在的代謝物與標(biāo)準(zhǔn)品的兩個(gè)或兩個(gè)以上參數(shù)，進(jìn)行匹配。
3）使用質(zhì)譜庫鑒定GC-MS檢測到的代謝物，包括商業(yè)數(shù)據(jù)庫（如NIST/EPA /NIH）、免費(fèi)數(shù)據(jù)庫（如Golm Metabolite Database）或?qū)嶒?yàn)室自建庫。樣本衍生代謝物的裂解質(zhì)譜與文庫中的裂解質(zhì)譜相匹配，并以匹配概率評分。
4）基于UPLC-MS方法，代謝物的鑒定主要是根據(jù)實(shí)際得到的譜圖和數(shù)據(jù)庫中（如HMDB（http://www.HMDB.ca/）、KEGG（http://www.genome.jp/KEGG/）、ChemSpider（http://www.ChemSpider.com/）的譜圖進(jìn)行比對，根據(jù)其匹配程度獲得鑒定結(jié)果。然而同一個(gè)代謝物在不同儀器平臺上獲得的圖譜是不同的；同一個(gè)儀器平臺上，不同分析條件下獲得的圖譜也不同等，這些都限制了代謝物的準(zhǔn)確鑒定。
結(jié)論
文章描述了血清/血漿樣品大規(guī)模代謝組學(xué)非靶分析過程中，包括樣品制備、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、信號校正和數(shù)據(jù)集整合過程等，如下圖所示。這為代謝組學(xué)非靶大規(guī)模研究提供了標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程，有助于人類的代謝組學(xué)研究發(fā)展。
