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經(jīng)典重讀丨Nat Methods基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)
基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)可以同時檢測和量化數(shù)千種代謝物特征。然而，由于代謝物的化學(xué)性質(zhì)復(fù)雜和動態(tài)范圍大，導(dǎo)致定性定量復(fù)雜。真實(shí)樣本往往是復(fù)雜體系，存在離子抑制、同分異構(gòu)等問題。為了獲得高質(zhì)量的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，德國馬普研究所的Saleh Alseekh提出了一份指南，涵蓋樣品制備、生物重復(fù)、定量分析、信號鑒定等。相關(guān)研究結(jié)果于2021年7月發(fā)表于Nature methods，文章標(biāo)題為“Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices”，原文鏈接為：https://doi.org/10.1038/s41592-021-01197-1。
代謝組學(xué)目前廣泛應(yīng)用于植物、微生物和哺乳動物研究，是對基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的補(bǔ)充研究，是一種常用的實(shí)驗(yàn)體系生物學(xué)工具。預(yù)計(jì)生命體系中存在超過100萬種代謝物，單個物種中約有1000~40000種。然而單一檢測方法所能覆蓋的代謝物數(shù)量十分有限，目前已經(jīng)開發(fā)了許多不同的提取技術(shù)、分析方法的組合，來嘗試盡可能多的提高代謝物覆蓋率。同時對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的不同注釋，這使得代謝組數(shù)據(jù)的多樣化極高，不利于實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的相互比較。因此，需要對代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，作者描述了基于氣相色譜/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)方法指南，涉及樣品制備、生物重復(fù)、定量分析、信號鑒定等，以便不同實(shí)驗(yàn)室之間可對數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和分享。
樣品采集、儲存和代謝物提取
代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)的第一個關(guān)鍵步驟是樣本收集，理想的淬滅溶劑應(yīng)能夠快速停止生物代謝過程并不影響后續(xù)代謝物的高效提取。常見的樣品類型包括細(xì)胞、組織等代謝高度活躍的系統(tǒng)，還有血清、血漿或尿液等生物體液樣本，每種樣本類型都需要特定的采集、淬滅和提取方法，并沒有通用型的方法。淬滅過程需要完全終止所有酶和化學(xué)活性，避免干擾當(dāng)下的代謝物水平。例如，組織樣本應(yīng)在快速切取后在液氮中速冷，隨后儲存于−80°C環(huán)境。
在代謝物的提取過程中，還需注意若干問題。比如當(dāng)研究目標(biāo)為強(qiáng)揮發(fā)性的代謝物時，不能對樣本進(jìn)行冷凍干燥；樣品不能儲存在0至40°C下，否則物質(zhì)可能會濃縮在殘留水相中；在分析前盡可能短的時間內(nèi)儲存完全干燥的殘留物。此外，必須確保在解凍過程中樣本中新陳代謝保持淬滅狀態(tài)，防止某些代謝物的消耗或轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)新的化合物或分解產(chǎn)物。培養(yǎng)基需要多個洗滌步驟來減少質(zhì)譜檢測過程中的離子抑制影響。
樣本重復(fù)和隨機(jī)化
代謝組學(xué)研究中，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和代表性，需要設(shè)計(jì)生物重復(fù)、技術(shù)重復(fù)和分析重復(fù)。生物重復(fù)就是常說的每組個數(shù)N值。技術(shù)重復(fù)是指對同一個樣本進(jìn)行多次相同的實(shí)驗(yàn)操作步驟和檢測，主要是對整個實(shí)驗(yàn)過程的評估，評價(jià)批次實(shí)驗(yàn)之間的誤差。分析重復(fù)是指重復(fù)對完全相同的提取后樣品進(jìn)行測定，主要用于評估儀器的穩(wěn)定性。
生物重復(fù)最為重要，數(shù)據(jù)結(jié)果體現(xiàn)了樣本個體間差異和技術(shù)重復(fù)差異，當(dāng)生物重復(fù)的差異遠(yuǎn)大于技術(shù)重復(fù)時，應(yīng)以生物重復(fù)為主。生物重復(fù)應(yīng)至少設(shè)置四個，理想的情況是越多越好，具體的重復(fù)數(shù)量取決于實(shí)驗(yàn)條件、統(tǒng)計(jì)需要和實(shí)驗(yàn)方差。
在整個代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，檢測時對生物樣品進(jìn)行時空隨機(jī)化同樣重要。如果以非隨機(jī)順序分析一組樣本，治療和對照樣本或時間點(diǎn)可能最終在不同的條件下進(jìn)行測量。因此，樣本年齡或儀器性能的變化可能會混淆解釋，掩蓋了樣本組之間的生物差異。因此，在大規(guī)模代謝組研究中，需要使用質(zhì)量控制樣品來監(jiān)測儀器性能和穩(wěn)定性，從而保證數(shù)據(jù)質(zhì)量。
定量分析
基于LC-MS和GC-MS方法進(jìn)行的非靶向代謝組學(xué)，獲得的數(shù)據(jù)通常是相對定量的。這是由于復(fù)雜混合物中不同代謝物的電離效率不同，不同代謝物的色譜-質(zhì)譜峰的相對強(qiáng)度（峰面積）與絕對濃度不直接相關(guān)。代謝物的相對濃度可以反應(yīng)變化的方向（變大或變小）。然而，代謝物的絕對濃度在確定酶結(jié)合位點(diǎn)、代謝反應(yīng)的熱力學(xué)和分子動力學(xué)研究中有更大的實(shí)用性。
當(dāng)然，代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定信號強(qiáng)度和濃度的線性關(guān)系，來實(shí)現(xiàn)代謝物的絕對定量。但是由于復(fù)雜混合物中許多代謝物的關(guān)系是非線性的，這使得獲得數(shù)千種標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量不可行。目前，常使用的定量方法是內(nèi)標(biāo)法定量或外標(biāo)法定量。
代謝組學(xué)定量分析的另一個問題是樣本的量化單位。組織通常按鮮重或干重，體液通常按體積，細(xì)胞通常按蛋白質(zhì)或細(xì)胞計(jì)數(shù)來計(jì)算。
回收率實(shí)驗(yàn)
回收率實(shí)驗(yàn)是指將標(biāo)準(zhǔn)化合物添加到初始提取溶劑中，以評估提取、儲存和處理過程中的損失，并可證明數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。然而，在代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)品以及有些分析物是未知的原因，回收率實(shí)驗(yàn)難以實(shí)現(xiàn)。因此，出現(xiàn)一種替代方法——提取重組，即將新的組織樣本的提取物通過與已知特征的參照樣本（如大腸桿菌、擬南芥或人類體液）的結(jié)合來表征。
對于已知的代謝物，建議對每種新的組織類型或物種進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，70~130%的回收率是可接受的范圍，回收率超出此范圍的代謝物應(yīng)進(jìn)行重新評估。
離子抑制
離子抑制是LC-MS分析中的一個普遍問題，因?yàn)榛|(zhì)效應(yīng)影響共洗脫分析物的電離，影響定量的精度和準(zhǔn)確性。評估離子抑制潛在影響的最佳方法是在重組實(shí)驗(yàn)中混合兩種獨(dú)立的提取物，并評估檢測到的代謝物是否可以定量回收。
減小離子抑制的方法：（1）改進(jìn)樣品制備方法，優(yōu)化樣本前處理步驟，包括超聲、溶劑選擇、過濾、離心和蛋白沉淀等，其中選擇合適的吸附劑進(jìn)行固相萃取（SPE）是減少基質(zhì)效應(yīng)的有效方法。（2）選擇合適的色譜條件，根據(jù)樣品類型和分析物性質(zhì)，選擇合適的色譜柱，調(diào)節(jié)色譜條件，改變流動相的組成或梯度條件，使得感興趣的分析峰不在抑制區(qū)域洗脫。（3）選擇合適的離子源，大氣壓化學(xué)電離（APCI）比電噴霧電離（ESI）更不易受到基質(zhì)效應(yīng)的影響，正離子模式下化合物電離比負(fù)離子模式更容易出現(xiàn)離子抑制。
信號鑒定
基于質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)時，代謝物的鑒定仍是很大的挑戰(zhàn)。高分辨質(zhì)譜可檢測到10000-100000個特征峰，除了準(zhǔn)分子離子峰外，還經(jīng)常出現(xiàn)加和離子峰和干擾離子峰。造成對離子峰誤判的原因包括以下幾個方面。（1）同分異構(gòu)體的存在：如己糖磷酸鹽/肌醇磷酸鹽、檸檬酸鹽/異檸檬酸鹽、葡萄糖/果糖、丙氨酸/肌氨酸等，高分辨率質(zhì)譜難以區(qū)分這些異構(gòu)體。（2）重疊化合物的存在可能會阻礙某些代謝物的檢測：當(dāng)色譜無法有效分離分析物時，分辨率不足的情況下會導(dǎo)致化合物信號重疊。（3）源內(nèi)降解物的形成：在ESI電離中，由于水、二氧化碳或磷酸氫的損失、復(fù)雜的分子重排和其他離子的附著從而產(chǎn)生副產(chǎn)物離子。源內(nèi)降解降低了代謝物母離子的信號強(qiáng)度，產(chǎn)生的碎片離子可能會干擾其它共洗脫化合物的分析。
此外，非靶代謝組學(xué)分析的一個關(guān)鍵方面是峰值過濾。此類研究中的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集包含大量無效信息，這些特征可能會阻礙后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析，可通過減少信號和噪聲的數(shù)量以及注釋常見同位素和加合物來改善和清潔數(shù)據(jù)。已有多種軟件工具可根據(jù)給定數(shù)據(jù)集的特定特征進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾。
報(bào)告注釋
為了在不同實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，方便其他實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)，需要對樣品制備和分析程序進(jìn)行詳細(xì)描述，包括前處理方法、色譜和質(zhì)譜參數(shù)。
（1）色譜：流動相組成、色譜柱品牌和型號、柱溫、流速和進(jìn)樣量；
（2）質(zhì)譜：離子源和檢測模式類型、MS方法、掃描次數(shù)和速度以及MS/MS參數(shù)，包括分辨率設(shè)置和用于碎裂的能量。
作者提供簡化、更簡單的報(bào)告注釋示例（下圖），以確保廣泛的適用性和相關(guān)性。
總結(jié)
本研究提出了提高代謝數(shù)據(jù)集質(zhì)量和建議，以滿足跨實(shí)驗(yàn)室可比的需要。這些建議包括樣品制備、生物重復(fù)、定量分析、信號鑒定、報(bào)告注釋等形成指南。指南將使讀者能夠評估所報(bào)告數(shù)據(jù)的質(zhì)量，使研究人員能有一個簡單的途徑來獲得所需的信息并注釋自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此外還可以使多個實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)更容易相互比較。這些都有助于代謝組學(xué)的發(fā)展。
