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文獻分享丨Cell Metab腫瘤與2-HG代謝流

前言

新陳代謝重編程是癌細胞的重要標志之一，代謝失調(diào)對癌癥發(fā)生和癌細胞存活十分重要。然而，目前尚不清楚這些因素在多大程度上相互作用促進癌癥的發(fā)生。這種重新編程的代謝已經(jīng)被用于癌癥的診斷、分期和分級，以及對腫瘤治療的反應。

2-羥基戊二酸（2-HG）是多種癌癥的生物標志物，是由于異檸檬酸脫氫酶（IDH1/2）突變導致的異常積聚，多種癌癥都表現(xiàn)攜帶IDH1/2突變。2-HG通過抑制α-酮戊二酸（a-KG）依賴的雙加氧酶和去甲基酶而與表觀遺傳學變化聯(lián)系在一起。2-HG作為生物標志物在檢測、診斷和治療監(jiān)測方面具有很大的潛力，但目前2-HG在體內(nèi)的主要代謝來源尚不清楚，難以解釋。

2017年11月，威爾康奈爾醫(yī)學院Kayvan R. Keshari課題組在《Cell Metabolism》期刊上發(fā)表了題為“In Vivo Imaging of Glutamine Metabolism to the Oncometabolite 2-Hydroxyglutarate in IDH1/2 Mutant Tumors”的研究成果。該研究利用超極化磁共振成像（HP-MRI）技術展示了在IDH1/2突變型腫瘤中HP[1-¹³C]谷氨酰胺（Gln）快速代謝為HP 2-HG的體內(nèi)實時成像，并用HP 2-HG無創(chuàng)性地檢測到體內(nèi)MIDH的特異性抑制。我們非常有幸邀請到深耕代謝組學的青年學者劉平輝，為我們帶來這篇文章的全方位解讀。原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2017.10.001。

研究結果

體外培養(yǎng)的IDH1/2突變體中Gln流向生成2-HG

既往研究發(fā)現(xiàn)在膠質瘤細胞異位表達IDH1突變體實驗中，Gln是形成2-HG的碳源。作者在不含Gln的培養(yǎng)基中添加[¹³C₅]Gln培養(yǎng)JJ012和CS1兩種細胞系，24h后兩種IDH突變體中幾乎所有總Gln和2-HG都被完全標記（m+5）（圖1A）。JJ012和CS1兩種細胞系在用[¹³C₆]葡萄糖（Gluc）孵育24h后，均顯示出極少量（約5%）的Gluc碳流入2-HG和Gln（圖1B, 1C）。胞質IDH1突變體（JJ012）在不含GLn的培養(yǎng)液中未積累大量的2-HG，而線粒體IDH2突變體（CS1）細胞在該條件下仍然能夠積累一定量的2-HG（圖1D）。這些結果證實了在正常生長條件下2-HG的主要來源是Gln。

作者進一步用m+5代謝物進行實時測量，發(fā)現(xiàn)在體外Gln會分布富集成谷氨酸和2-HG（圖2A-2D）。在JJ012和CS1中，GLn標記谷氨酸的速率分別為17.9±1.3nmol/百萬細胞和16.0±1.4nmol/百萬細胞；Gln標記2-HG的速率分別為1.90±0.08nmol和1.27±0.07nmol/百萬細胞，2-HG產(chǎn)生的速率足夠高，這也是為何腫瘤中發(fā)現(xiàn)2-HG積聚。作者猜想轉化速率足夠高，那可否利用HP GLn作為成像探針在體內(nèi)進行檢測。

圖1 在體外IDH1/2突變體中谷氨酰胺流向產(chǎn)生2-HG

圖2 Gln轉化為谷氨酸和2-HG的體外動力學為體內(nèi)HP-MR提供了可能

體外抑制IDH可調(diào)節(jié)GLn生成2-HG的動力學

為檢測給定治療導致的2-HG產(chǎn)生的變化，作者評估了在mIDH1模型中2-HG的產(chǎn)生是否可以在體外被調(diào)節(jié)。首先，作者確定了mIDH1抑制劑AGI-5198的特異性，JJ012細胞對該抑制劑表現(xiàn)出劑量依賴性的反應, 在3-5μm時對2-HG形成的抑制作用最高，IC50為0.21μm，AGI-5189對CS1細胞有輕微的抑制作用（圖3A, 3B）。接著，作者試圖確定在含2μM的AGI-5198與JJ012細胞共孵育96h后，抑制突變型IDH1對JJ012細胞中Gln生成2-HG動力學的影響。抑制作用不影響GLn到谷氨酸的流通量，但2-HG的生成減了大約70%，此顯著差異可能大到足以通過體內(nèi)的HP-MRI進行量化（圖3C, 3D）。

圖3 mIDH1細胞中2-HG的產(chǎn)生速率可在體外使用mIDH1抑制劑藥物進行調(diào)節(jié)

[1-¹³C]Gln的超極化及微量焦谷氨酸生成

Gln作為體內(nèi)2-HG生成的成像探針有效性取決于所能達到的極化水平和T₁弛豫時間，為了確定這兩個參數(shù)，將[1-¹³C]Gln溶解在等摩爾量的NaOH中，并與OX063自由基甘油溶液混合。樣品超極化>1h，溶解后即可極化水平達到34.7%±7%，T₁為31±3s（圖4B, 4C）。在溶液中，GLn會自發(fā)轉化為焦谷氨酸（PG）。它們在生理pH下的¹³C NMR化學位移分別為174.7 ppm和180ppm，溶解后立即觀察到少量的HP PG （圖4D, 4C）。此外，作者發(fā)現(xiàn)C1 GLn的化學位移隨pH漂移幾ppm，為避免體內(nèi)外結果差異產(chǎn)生的誤導，當HP[1-¹³C]Gln樣品溶解時需中和得到生理pH下的極化溶液。

圖4 [1-¹³C]Gln可在極少量PG形成的情況下超極化

通過HP[1-¹³C]Gln可在體內(nèi)對HP[1-¹³C]2-HG的形成實時成像

根據(jù)此前體外模型中Gln轉化為2-HG的動力學，作者假設2-HG的形成可能使用超極化[1-¹³C]Gln作為成像探針進行實時檢測。測定了Gln在JJ012移植瘤中的轉運動力學和2-HG的出現(xiàn)時間，Gln信號很可能是來自[1-¹³C] Gln和[1-¹³C] Glu的復合信號， [1-¹³C] 2-HG信號在24 – 27s之間出現(xiàn)，在30 – 33s之間達到最大值，在42s時消失。接著，作者利用動態(tài)采集的時間對兩種腫瘤模型進行二維化學位移成像。圖5A和5B顯示了[1-¹³C] Gln+Glu（峰值為175ppm）信號在小鼠體內(nèi)的分布，腫瘤區(qū)域內(nèi)在180.8 ppm時可以觀察到一個額外的峰值，將其指定為HP[1-¹³C]2-HG，而其他正常組織中沒有該額外峰（圖4D, 5A）。在JJ012和CS1腫瘤中觀察到的180.8 ppm峰是源自于HP [1-¹³C] Gln探針的[1-¹³C] 2-HG。

為評估此方法是否反映了IDH1和IDH2突變體之間的動力學差異，將兩種腫瘤細胞的HP 2-HG信號面積歸一化，結果顯示CS1的信號比JJ012的信號低34%； CSI和JJ012腫瘤中2-HG的濃度分別約為1.42±0.26 nmol/g 和2.15±0.17 nmol/g（圖5C）。

使用HP [1-¹³C]Gln可在體內(nèi)評估IDH1突變體的抑制作用

接著，作者使用HP [1-¹³C] Gln在體內(nèi)評估AGI-5198對IDH1突變體的抑制潛力。測定了JJ012基線2-HG水平和基線光譜，兩次注射HP [1-¹³C] Gln并使用mIDH1抑制劑進行治療，與基線相比HP 2-HG信號顯著下降約40%（圖5D）。該方法能夠評估Gln生成2-HG的體內(nèi)調(diào)節(jié)，以及在單劑量給藥后不久對抑制療法的實時反應。

圖5 利用HP[1-¹³C] Gln作為成像探針，在體內(nèi)實時檢測2-HG的形成

Gln在體內(nèi)轉化為2-HG的動力學促進HP成像

以上研究結果表明在用于HP成像時，Gln是2-HG的主要碳源，反應足夠快可在體內(nèi)用HP [1-¹³C] Gln檢測到。為消除體外結果轉化為體內(nèi)成像的歧義，給腫瘤小鼠注射[¹³C₅] Gln以確定2-HG的生成率。通過腫瘤組織的¹H-NMR分析確定了2-HG在JJ012和CS1腫瘤中的總水平分別為6.2±0.6 Mm和4.7±0.6 mM，谷氨酸總水平分別為16.6±1.5 mM和13.5±2.6 Mm；LC-MS代謝示蹤分析顯示，在30min內(nèi)，[¹³C₅] 2-HG在JJ012和CS1腫瘤模型中分別累積了38.7±0.9 nmol/g和37.9±6.7 nmol/g（圖6A-6C）。這些數(shù)據(jù)進一步證實了IDH突變體體內(nèi)Gln代謝為2-HG的快速動力學。

圖6 Gln在體內(nèi)轉化為2-HG的動力學足夠快可用于HP成像

圖7 葡萄糖碳在HP注射時間內(nèi)沒有進入2-HG

接著，作者試圖將[¹³C₆] Gluc標記的體外結果轉化到體內(nèi)，并驗證觀察到的Gln代謝表型是在HP成像所需的快速注射方案下形成2-HG的主要來源。為此，作者給腫瘤組織另外注射了[¹³C₆] Gluc或[¹³C₅] Gln。在JJ012和CS1腫瘤中，3-磷酸甘油醛m+3的增加以及m+2異檸檬酸進入TCA循環(huán)證實了[¹³C₆]Gluc的代謝，[¹³C₅]Gln的代謝分別在甘油醛-3-磷酸和異檸檬酸的m+3和m+4標記中得到證實（圖7A-7D）。盡管[¹³C₆]Gluc碳進入了TCA循環(huán)，但沒有觀察到2- HG的m+2標記，而來自[¹³C₅]Gln的相對標記2-HG m+5達到了定量實驗預期的水平（圖7E, 7F, 6C）。這些體外研究證實了影像學實驗中抑制作用研究的結果，并支持該研究檢測潛在療法療效方法的可行性（圖7G）。

總結

作者提供了證據(jù)支持Gln可能是2-HG的主要來源，并開發(fā)了一種非侵入性成像方法，利用HP-MR實時檢測Gln中2-HG的活性形成。
通過同位素示蹤證實了在表達IDH1/2突變的腫瘤細胞系JJ012和CS1中，2-HG主要由Gln通過谷氨酰胺分解而來。
胞內(nèi)IDH1突變體在Gln耗竭條件下不積累2-HG，相同情況下mIDH2細胞仍然可以積累少量的2-HG，表明每種突變細胞的新陳代謝重編程存在根本差異。
Gln轉化為2-HG速率足夠高，可利用HP GLn作為成像探針在體內(nèi)進行檢測
通過HP[1-¹³C]Gln可在體內(nèi)對HP[1-¹³C]2-HG的形成實時成像，還可評估IDH1突變體的抑制作用