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新文速遞丨Ind Crops Prod元素組評(píng)價(jià)草果道地性
草果干燥的成熟果實(shí)或種子是東亞和東南亞，特別是中國(guó)重要的食品添加劑、香料和藥物，地理產(chǎn)地關(guān)系到它的整體品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值。復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院、云南中醫(yī)藥大學(xué)以及河南中醫(yī)藥大學(xué)合作，通過(guò)ICP-MS建立了一種定量元素組學(xué)方法，構(gòu)建了包括58種元素的草果種子元素譜，發(fā)現(xiàn)草果所含常量必需元素均值范圍較窄，非必需元素除Na、S、Cr外均呈現(xiàn)較寬范圍。32種元素（Li，B，Na，Mg，Al，Si，P，S，K，Ca，V，Cr，Mn，F(xiàn)e，Co，Ni，Cu，Zn，Ge，As，Rb，Sr，Mo，Ag，Cd，Sn，Cs，Ba，La，Ce，W，Pb）的多元素指紋圖譜及十五種元素（B，Mg，Al，P，S，K，Ca，V，Mn，F(xiàn)e，Co，Ni，Sr，Mo，Ba）濃度的組合可用于判斷草果種子道地性。相關(guān)研究成果于2023年1月發(fā)表在Industrial Crops & Products雜志上，文章標(biāo)題為“Multi-element fingerprinting approach for geographical authentication of Amomum tsaoko seed”，原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669023001097。
研究背景
草果為姜科多年生草本植物，其干燥成熟的果實(shí)或種子是東亞和東南亞重要的食品添加劑和香料，在中國(guó)常用于治療寒濕內(nèi)阻、脘腹脹痛、脹滿嘔吐、瘧疾寒熱、瘟熱等。近年來(lái)，由于消費(fèi)增加和草果野生種群的逐漸消失，草果的人工栽培面積有所增加，而草果的質(zhì)量通常受產(chǎn)地的影響�；谠亟M成的指紋圖譜方法已被廣泛用于道地性研究，目前幾乎沒(méi)有關(guān)于草果中元素含量的報(bào)道，此外草果中元素濃度水平之間的相關(guān)性也尚不清楚。本研究利用ICP-MS建立了一種有效的定量元素組學(xué)技術(shù)，研究來(lái)自12個(gè)產(chǎn)地（表1）的草果種子道地性。
表1. 草果產(chǎn)地等信息
研究結(jié)果
1.元素概況
草果樣品中元素檢出情況如圖1所示，常量必需元素是維持植物生長(zhǎng)和完成其生命周期所需的基本元素，表現(xiàn)出較窄的范圍。草果種子常量必需元素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)由大到小依次為：Cu > Zn > K > Ni > B > Mg > P > Ca > Mn > Fe > Mo。相比之下，非必需元素除了Na、S和Cr（圖 2 A）之外，尤其是Ba、Ti、Br、Sn、Cl、Zr、Ga、Y、Ag、Tl、Nb、U、Th、Bi、Hf、Au，呈現(xiàn)較寬范圍。重金屬分布于植物的各個(gè)部位，通過(guò)食物鏈影響人體健康。當(dāng)重金屬在體內(nèi)蓄積時(shí)，可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性取代必需元素，比如Cd會(huì)取代存在于金屬硫蛋白中的Zn，從而導(dǎo)致Zn代謝紊亂，抑制細(xì)胞中自由基清除。此外，重金屬的積累導(dǎo)致抗氧化失衡并影響酶的功能和多種激素的活性，As（主要是無(wú)機(jī)As）、Cd、Hg和Pb具有很強(qiáng)的毒性，可能對(duì)人類和動(dòng)物的健康產(chǎn)生不利影響。
圖1. 所有樣品都檢測(cè)到加粗黑色字體（有色背景）所示的元素，其中淺黃色背景黑色字體元素（Be, Se, Ru, Rh, Pd, Te, Ta, Re, Os, Ir, Pt）在所有樣品中低于定量限（LOQ）
FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)確定了角叉菜中As、Cd、Hg和Pb的最高含量（As < 3×103 µg/kg，Cd < 2×103 µg/kg，Hg < 1×103 µg/kg，Pb < 5×103 µg/kg），中國(guó)藥典委員會(huì)確定了19種草藥中As、Cd、Hg和Pb的最高含量（As < 2×103 µg/kg，Cd < 1×103 µg/kg，Hg < 2×102 µg/kg，Pb < 5×103 µg/kg）。在本研究中，As含量范圍為20.3-52.5 µg/kg，Cd為16.3-117.1 µg/kg，Pb為8.8-42.5 µg/kg。同時(shí)，汞的水平描繪了種群之間的明顯分離。在GS、FG、PB、JP和TC這些產(chǎn)地的草果中，所有樣品汞含量均低于LOQ。YY的水平最高，為117.1 µg/kg。然而，它們都遠(yuǎn)低于最高水平，這顯示了草果種子的安全性。
圖2. 草果種子的元素概況 (A) 每個(gè)群體中可定量元素的平均濃度。(B) 草果種子所有樣本的平均濃度及其變異系數(shù)（CV）均高于100%。
鑭系元素被植物根系從土壤中吸收，因此可作為地理標(biāo)記在食品工業(yè)中應(yīng)用。本研究測(cè)量了13種鑭系元素。但是，所有樣品中只有Ce、La和Pr高于LOQ。對(duì)于非常接近LOQ的Er和Tm，僅在GS中能定量測(cè)到。此外，Yb和Tb在兩個(gè)種群中被定量測(cè)到，Ho在三個(gè)定量中被量化（圖 2A）。因此，單獨(dú)的鑭系元素?zé)o法作為草果種子的標(biāo)記物。
2. 元素相關(guān)性
對(duì)58種元素進(jìn)行相關(guān)性分析，在圖3A和圖3B中，相關(guān)系數(shù)被分別描繪為p < 0.05，p < 0.001的彩色點(diǎn)。元素Mg、S、B、P和K彼此呈正相關(guān)。其中Mg、S、B、P與Ni呈正相關(guān)，S、B、P、K與Fe呈負(fù)相關(guān)，S、B、P與Mo呈負(fù)相關(guān)，P、K與Sb呈負(fù)相關(guān)。Mn、Cd、Zn，Tl之間呈正相關(guān)，與Mo呈負(fù)相關(guān)；Mn、Cd與Ga、Ag、Co、Br呈正相關(guān)，與Ca呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)，觀察到元素Th、Gd、U、Y、Dy、Pr、La、Ce、Nd、Bi、Al、V之間呈正相關(guān)，同時(shí)與Tm、Ho、Tb、Er也呈正相關(guān)。Tm、Ho、Tb、Er、Yb呈正相關(guān)。Pr、La、Ce、Nd與Rb呈負(fù)相關(guān)。值得注意的是，Ga、Ni、Cu，Ge、Pb、Cs，Sr、Ba、Sm元素之間存在顯著的正相關(guān)。此外，元素Ga和Ag、Co和Br、Ti和Zr、Si和Fe、Fe和Sb分別彼此正相關(guān)。同時(shí)，Mo與Na、Co、Br呈負(fù)相關(guān)。在現(xiàn)階段，雖然很難闡明這些關(guān)系，但它們?yōu)椴莨纳韺W(xué)研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了重要的依據(jù)。
圖3. 58種元素之間的相關(guān)性。正相關(guān)用紅點(diǎn)表示，負(fù)相關(guān)用藍(lán)點(diǎn)表示，點(diǎn)的權(quán)重代表相關(guān)系數(shù)的值。(A) 相關(guān)系數(shù)顯示為彩色點(diǎn)，p < 0.05。(B) 相關(guān)系數(shù)顯示為彩色點(diǎn)，p < 0.001。
3.道地性分析
對(duì)58種元素與經(jīng)度、緯度、海拔高度進(jìn)行相關(guān)性分析。相關(guān)系數(shù)等于或大于0.5且p值小于0.05作為報(bào)告數(shù)據(jù)的限值。如圖4A所示，經(jīng)度與B、Mg、P、S、Co呈正相關(guān)，與Sr、Fe、Sm呈負(fù)相關(guān)。緯度與Sr、Fe、Mo呈正相關(guān)，與Ba、B、Mg、P、Co呈負(fù)相關(guān)。海拔與Ba、Sr、Fe、Co、Sm呈正相關(guān)，與Mg、P、S、Mo呈負(fù)相關(guān)。涉及的元素有十種，其中B、Mg、P、Fe、Mo各占一半，為必需元素，Sm為鑭系元素，隨后進(jìn)行層次聚類分析，采用Pearson距離和ward聚類方法，結(jié)果如圖4B所示，很難將其與地理起源聯(lián)系起來(lái)，表明草果種子中元素的積累不僅受位置的影響，還受土壤、氣候等其他因素的影響。
根據(jù)“80%規(guī)則”，超過(guò)80%樣本中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)已知的32種元素（Li、B、Na、Mg、Al、Si、P、S、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ge、As、Rb、Sr、Mo、Ag、Cd、Sn、Cs、Ba、La、Ce、W、Pb）用于進(jìn)一步層次聚類分析如圖5A所示。來(lái)自12個(gè)種群的樣本被分為三類。第1組包括LC、YJ、TC、JP和YY。第2組包括PB、HK和MG。第3組由DLJ、GS、FG和LS組成。除了JP外，與之前關(guān)于草果種子精油與局部生長(zhǎng)之間相關(guān)性的研究中顯示的模式相似。根據(jù)植物區(qū)系理論，JP與PB、HK和MG（第2組）一起位于II區(qū)。然而，JP在地理上比PB更接近YY（圖 5B），需要在以后的研究中給予更多的關(guān)注。然后通過(guò)OPLS-DA分析，結(jié)果表明組1 vs組2、組1 vs組3、組2 vs組3均有顯著差異，Q2大于0.95 和p值小于5.25×10-23（圖 5C-E）。這意味著這32個(gè)元素可用于構(gòu)建草果種子地理鑒定的指紋識(shí)別模型。
圖6. 15種元素的層次聚類分析(HCA)，通過(guò)多變量ROC曲線分析過(guò)濾。(A) 不同組的HCA。(B) 不同種群的HCA。
LS和TC在地理位置上彼此靠近。在以后的研究中也需要更多的關(guān)注。ROC過(guò)濾的15種元素包括9種常量必需元素B、Mg、P、K、Ca、Mn、Fe、Ni、Mo和6種非必需元素Al、S、V、Co、Sr、Ba。與過(guò)濾80%的32種元素相比，缺失了Li、Na、Si、Cr、Cu、Zn、Ge、As、Rb、Ag、Cd、Sn、Cs、La、Ce、W和Pb。但是，在32種元素組合中，有As、Cd、Pb這三種有毒元素和兩種鑭系元素La、Ce。由于有毒元素在食品添加劑和草藥中非常重要，32元素的組合在質(zhì)量控制中也起著至關(guān)重要的作用。
討論
本研究描述了草果種子中的元素分布，所有樣品中69種元素中有11種（Be、Se、Ru、Rh、Pd、Te、Ta、Re、Os、Ir和Pt）低于LOQ。結(jié)果表明，常量必需元素的范圍很窄，而非必需元素除Na、S和Cr外均呈現(xiàn)較寬的均值范圍，有毒元素方As、Cd、Hg、Pb的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在安全范圍內(nèi)，鑭系元素?zé)o法單獨(dú)作為草果種子標(biāo)記物。此外，目前的研究已經(jīng)顯示出58種元素之間的相關(guān)性。盡管很難闡明這些關(guān)系，但它們?yōu)椴莨韺W(xué)研究和制定草果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要依據(jù)。元素與經(jīng)度、緯度、海拔的相關(guān)結(jié)果很難與地理起源聯(lián)系起來(lái)，草果種子中元素的積累不僅受到地理位置的影響，還受到其他因素的影響。80%規(guī)則過(guò)濾的32個(gè)元素組合和ROC過(guò)濾的15個(gè)元素組合均可用于建立草果種子地理鑒定的指紋識(shí)別模型。同時(shí)，32種元素組合由于其中含有As、Cd、Pb三種有毒元素對(duì)草果種子的質(zhì)量控制也起著至關(guān)重要的作用。
