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干貨分享丨代謝流分析介紹
01 什么是代謝流分析？
代謝流分析（Metabolic Flux Analysis, MFA）是利用穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)，檢測(cè)下游代謝產(chǎn)物的同位素取代形式（M+0/ M+1/ M+2/ …），從而分析出該化合物在代謝通路中的流向和分布。通過對(duì)生物體進(jìn)行代謝流分析，可得到生物體特定代謝通路的活躍程度。
02 為什么要做代謝流分析？
通常代謝組學(xué)檢測(cè)的是生物樣本中的代謝物濃度，而代謝流反映的是細(xì)胞內(nèi)代謝反應(yīng)的速率。這其中就包括在酶參與下的中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、代謝物在各器官、組織間的轉(zhuǎn)運(yùn)速度等。用交通車流來舉個(gè)例子：馬路上的車流量（通量）隨著車輛數(shù)量（濃度）的增加而增加，當(dāng)發(fā)生交通擁堵時(shí)，車輛數(shù)量（濃度）是高峰，而車流量（通量）確近乎零。同樣，在代謝過程中，代謝物的積累（高濃度）可能是由于合成的增加，也可能是由于代謝的減少。要想知道這個(gè)代謝物的主要活性途徑、各個(gè)途徑的相對(duì)貢獻(xiàn)和分布變化特點(diǎn)，就需要用到代謝流分析。
因此，代謝流能揭示代謝調(diào)節(jié)的位點(diǎn)和機(jī)理，并且加深我們對(duì)代謝物如何參與細(xì)胞決策的理解。此外，在病變細(xì)胞中，代謝流信息也能幫助我們進(jìn)行治療手段的選擇。
03 哪些情況需要做代謝流分析？
需要回答“從哪來？”和“到哪去？”的研究，都需要做代謝流分析。舉例 ：腫瘤細(xì)胞的碳源來源、特定靶點(diǎn)誘導(dǎo)或抑制后代謝通路的活躍或抑制程度。
與代謝流相關(guān)的幾個(gè)常見的關(guān)注問題是：1）發(fā)現(xiàn)特定營養(yǎng)物的分解代謝命運(yùn)；2）發(fā)現(xiàn)一個(gè)給定的細(xì)胞內(nèi)化合物的生物合成起源；3）對(duì)特定代謝節(jié)點(diǎn)或反應(yīng)的通量進(jìn)行有針對(duì)性的分析；4）測(cè)定細(xì)胞氧化還原平衡（例如：NADPH和NADH）和能量（ATP）載體。
04 代謝流分析如何做實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)？
代謝流一般有兩種基本的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方式，包括靜態(tài)實(shí)驗(yàn)和非靜態(tài)實(shí)驗(yàn)。
靜態(tài)實(shí)驗(yàn)：在同位素標(biāo)記平衡終點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量。優(yōu)點(diǎn)：同位素標(biāo)記模式完全取決于代謝物水平。缺點(diǎn)：只能解決不同通路對(duì)同一衍生物的相對(duì)貢獻(xiàn)率，不能根據(jù)時(shí)間進(jìn)行線性定量，需要持續(xù)足夠的時(shí)間以達(dá)到同位素穩(wěn)態(tài)。
非靜態(tài)實(shí)驗(yàn)：在達(dá)到同位素標(biāo)記平衡之前進(jìn)行測(cè)量。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)記實(shí)驗(yàn)可以短至幾分鐘，可以根據(jù)時(shí)間進(jìn)行線性定量。缺點(diǎn)：需要對(duì)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的同位素標(biāo)記情況進(jìn)行測(cè)量，樣本的檢測(cè)和分析過程更為復(fù)雜，并且，同位素標(biāo)記水平取決于代謝流量和細(xì)胞內(nèi)代謝物水平。
因此，我們首先要明確所關(guān)注代謝通路和相關(guān)代謝物，然后往培養(yǎng)基中添加13C標(biāo)記的“來源物質(zhì)”，根據(jù)相關(guān)代謝通路確定合適的培養(yǎng)時(shí)間，收獲樣本（細(xì)胞、培養(yǎng)基）后液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80度冰箱保存，送檢時(shí)使用干冰快遞寄出。
05 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間是多長？
沒有一個(gè)固定值，對(duì)于靜態(tài)實(shí)驗(yàn)來說，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間（標(biāo)記的持續(xù)時(shí)間）取決于感興趣的途徑多長時(shí)間達(dá)到一個(gè)代謝穩(wěn)態(tài)。通常在糖酵解途徑中是10分鐘，TCA循環(huán)約2小時(shí)，核苷酸則需要不少于24小時(shí)。
06 代謝流檢測(cè)用什么技術(shù)？
主要是用質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)于豐度較高的代謝物如葡萄糖也可以用NMR技術(shù)。質(zhì)譜主要是利用不同取代形式的質(zhì)量數(shù)有差別進(jìn)行區(qū)分。
07 博萊克可以檢測(cè)哪些代謝流？
從理論上說，靶向定量檢測(cè)項(xiàng)目中包括的代謝物，我們都可以檢測(cè)代謝流。比如TCA、膽汁酸、氨基酸等。但是并不是所有目標(biāo)物都有合適的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體情況需要咨詢我們。
08 代謝流結(jié)果會(huì)以什么形式交付？
大部分時(shí)候，我們交付的是相對(duì)定量結(jié)果，即該種同位素形式占總和的百分比。該目標(biāo)物各種同位素形式的峰面積之和為1。
如果客戶有特殊要求，我們會(huì)根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目評(píng)估是否可以做絕對(duì)定量，交付濃度結(jié)果。但是對(duì)于豐度較低的同位素形式，可能存在定量結(jié)果不準(zhǔn)確（低于定量限）甚至檢測(cè)不到的情況。
09 送檢需要的樣本類型和樣本量是多少？還需要哪些信息？
細(xì)胞和培養(yǎng)基上清均可以檢測(cè)代謝流，樣品量根據(jù)關(guān)注的代謝通路有所區(qū)別，詳情可以咨詢我們。
除了樣品類型、細(xì)胞個(gè)數(shù)以外，還需要告訴我們細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的使用的同位素（取代信息）和關(guān)注的目標(biāo)物。
10 結(jié)果中M+2是什么意思？
我們用M來代表未被取代的目標(biāo)物，M+1代表分子量比目標(biāo)物+1（如果是13C標(biāo)記物培養(yǎng)的，就代表有1個(gè)12C被13C取代了的形式），M+2以此類推。
以丙酮酸為例，實(shí)驗(yàn)用13C全標(biāo)的谷氨酰胺培養(yǎng)，就會(huì)存在M/M+1/M+2/M+3共4種同位素取代形式，因?yàn)楸岜旧碇挥?個(gè)碳原子。M+2又會(huì)有3種同分異構(gòu)體形式，質(zhì)譜無法區(qū)分這些同分異構(gòu)體，給出的是這3種同分異構(gòu)體之和。
