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合作文章丨J Pharm Anal�；鈮A定量方法開發(fā)
酰基肉堿主要來源于線粒體、過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的脂肪酸和支鏈氨基酸。根據(jù)�；滈L度可分為短鏈(C2-5)、中鏈(C6-12)、長鏈(C13-20)和超長鏈(> C20)�；鈮A，其中部分酰基肉堿的�；溕虾辛u基、羧基或側(cè)鏈甲基，或與許多親水性化合物（包括氨基酸、葡萄糖醛酸和磺酸）共軛。這些�；鈮A不僅在脂質(zhì)和氨基酸的代謝穩(wěn)態(tài)、脂肪酸運輸和宿主-微生物共生等方面發(fā)揮著重要作用，而且部分�；鈮A作為2型糖尿病、心血管疾病、阿爾茨海默病、非酒精性脂肪性肝病、腫瘤和先天性代謝缺陷的生物標志物。然而，各種�；鈮A的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)存在巨大差異，目前仍然缺乏高通量高覆蓋的酰基肉堿定量方法用于支鏈、羥基化、羧化和共軛�；鈮A的功能研究。
超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS）在同時定性定量�；鈮A方面具有巨大的潛力。超高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜法（UPLC-HRMS）受限于掃描速度和動態(tài)范圍，故對于含有多不飽和、羥基化和羧化�；湹牡拓S度酰基肉堿具有較低的定性定量準確性。相對地，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）目前作為超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）定量分析的最佳選擇，存在熱不穩(wěn)定性、覆蓋度低、通量低或異構(gòu)體區(qū)分有限等問題。因此，所有報道的UPLC-MS/MS方法只覆蓋了少數(shù)羥基化和羧化的�；鈮A，而沒有共軛的�；鈮A。此外，基于UPLC-MS/MS的高覆蓋�；鈮A定量方法的主要瓶頸之一是缺乏可靠的標準品來獲得所有可能的�；鈮A的保留時間（tR）。然而，定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系（QSRR）建模雖然有助于預(yù)測�；鈮AtR，但這類研究只考慮了�；溕系奶荚雍碗p鍵數(shù)量。
復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院分子表型代謝組平臺唐惠儒教授團隊首先開發(fā)了一種基于UPLC-MS/MS結(jié)合MRM采集模式的定量方法，可用于在10分鐘內(nèi)同時定量生物體液和組織中所有可識別的�；鈮A。然后，利用酰基肉堿7個結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建了其tR值的QSRR模型用于預(yù)測更多�；鈮A的tR值，從而進一步建立了文獻中檢測到的1136種酰基肉堿的MRM參數(shù)（tR、MRM離子對與碰撞能量值）數(shù)據(jù)庫。最后，該團隊進一步定量了兩種典型人體生物體液（血漿和尿液）和五種典型動物模型組織中的酰基肉堿，以揭示其分子表型特征。
研究方法
首先，采用異丙醇/水溶液提取不同生物基質(zhì)中酰基肉堿。再者，采用UPLC-QTOFMS定性分析�；鈮A標準品的tR與特征碎片，并鑒定出不同生物基質(zhì)中�；鈮A種類。然后，基于R語言中LM函數(shù)來構(gòu)建�；鈮AtR值的QSRR預(yù)測模型、并建立文獻中檢測到的1136種�；鈮A的MRM參數(shù)（tR、MRM離子對、碰撞能量）數(shù)據(jù)庫。最后，經(jīng)方法學(xué)考察，對多種生物基質(zhì)中�；鈮A進行定量分析與分子表型描述。
研究內(nèi)容
1. 基于UPLC-QTOFMS多種基質(zhì)�；鈮A分析
相比負離子模式，在正離子模式下所有酰基肉堿均產(chǎn)生更強烈的信號，包括母離子[M]+（源于左旋肉堿季銨陽離子）、[M-59.0735]+（N(CH3)3的中性損失）和來自左旋肉堿部分的三個特征碎片（m/z 144.1019、85.0284和60.0808）。同時，所有共軛�；鈮A均產(chǎn)生母離子[M]+、[M-共軛物-59.0735]+和來自肉堿部分的三個特征碎片。由于特征碎片m/z 85.0284響應(yīng)值均最強，故 [M]+/85.0284可作為�；鈮A的MRM定量離子對。[M-共軛物-59.0735]+是共軛�；鈮A唯一的高響應(yīng)特征碎片，故[M]+/[M-共軛物-59.0735]+可用于作為定量MRM離子對�；谏鲜鯩RM定性定量分析方法，多種生物基質(zhì)（兔肝組織、人源血漿、尿液和細胞）及其混合樣品中鑒定出471種�；鈮A，其中包括395種�；鈮A和76種共軛酰基肉堿。
圖1 （A）�；鈮A（C10:0）與（B） N -乙酰半胱氨酸共軛-羥基酰基肉堿（N-acetylcys-C10:1-OH-CA）在正離子模式下的碎裂模式。
2. �；鈮A定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(QSRR)和MRM參數(shù)數(shù)據(jù)庫
利用R語言中LM函數(shù)構(gòu)建了該色譜條件下�；鈮A的QSRR模型（式3），45種�；鈮A標準品的計算保留時間（tRC）與實驗結(jié)果（tRE）具有良好的線性相關(guān)性（r2> 0.998）和準確性（△tR< 0.20 min，MAE < 0.07 min）。該模型對于混合樣品中檢測到的所有211個�；鈮A均具有良好的tRC與tRE相關(guān)性（r2 ~ 0.984）和預(yù)測精度（MAE< 0.21 min和△tR < 0.9 min），其中包括不同�；兼�、支鏈甲基、碳碳雙鍵、羥基或羧基數(shù)目的�；鈮A。即使在這些結(jié)構(gòu)特征同時存在的情況下，從混合樣品中鑒定出97%�；鈮A的tRC與tRE相關(guān)性和準確性均優(yōu)�；诖�，一個MRM參數(shù)（tR、MRM離子對和碰撞能量）數(shù)據(jù)庫被進一步建立，其中涵蓋了含398個化學(xué)結(jié)構(gòu)式的1136種�；鈮A（包括�；鈮A、共軛肉堿及其異構(gòu)體）。
tRC = k0 + k1c3 + k2c2 + k3c + k4b+ k5d + k6h + k7j+ k8p + k9q+ k10ch (式 3)
（其中，k0 = –0.252, k1 = 8.54×10–4, k2 = –4.82×10–2, k3 = 1.06, k4 = –0.487, k5 = –0.172, k6 = –1.65, k7 = –1.55, k8 = 0.152, k9 = –1.59×10–2與k10 = 7.20×10–2。模型中變量c、b、d、h、j分別表示�；溙�、支鏈甲基、碳碳雙鍵、羥基、羧基的個個數(shù)，p、q表示支鏈和雙鍵的位置。）
圖2（A）45個�；鈮A標準品與（B）生物樣品中檢測到的�；鈮A模型計算保留時間（tRC）與實驗結(jié)果（tRE）的比較。
3. 多種生物基質(zhì)中酰基肉堿的定量分析以表征其分子表型
在2種典型的人源生物液體（血漿和尿液）和5種小鼠組織（腎臟、肝臟、心臟、肺和肌肉）中共定量出514種酰基肉堿，用于表征其酰基肉堿分子表型。其中，人源尿液樣本中含有421種�；鈮A多于人源血漿（149種）和小鼠組織（包括腎211種、肝195種、心臟189種、肺188種與肌肉169種），特別是共軛酰基肉堿與含有羥基和羧基的�；鈮A。
圖3 多種生物基質(zhì)中不同類型的飽和（sAC）、不飽和（uAC）、羥基化（AC-OH）、羧化（AC-DC）與共軛�；鈮A（CAC）的濃度（c）。其中粗線（sum）與細線表示每類總濃度與每種濃度分布。
全文總結(jié)
建立的高通量UPLC-MS方法可實現(xiàn)多種生物基質(zhì)中數(shù)百種�；鈮A和共軛�；鈮A的定量分析。同時，構(gòu)建的定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系模型，可用于無標準品條件下�；鈮A的tR值預(yù)測。最后，該定量方法通過量化2種人源生物體液與5種小鼠組織中500多種酰基肉堿，不僅為這些生物基質(zhì)的分子表型提供了數(shù)據(jù)，也為大型隊列疾病研究提供了一種重要且可靠的分析技術(shù)。多種生物基質(zhì)的高通量高覆蓋�；鈮A定量方法于2023年10月發(fā)表在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域期刊J Pharm Anal上(online)。
