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干貨分享丨全血/血漿/血清/紅細胞中脂肪酸檢測
在科研工作中，你是不是也曾被這個問題困擾？
在調(diào)研文獻的時候，明明都是測脂肪酸，有的文獻是測全血，有的是血漿，有的是血清，甚至還有測紅細胞的？到底哪種樣品類型最合適？
好不容易確定了這個問題，檢測方又拋出了一個新問題，是要測總脂肪酸？還是測游離脂肪酸？大腦CPU都要被燒干了，這兩者又有什么區(qū)別？
接下來，我們用最具學(xué)術(shù)精神的回答，溯源每個問題的本真。
各種類型血樣的權(quán)威定義？
全血（Whole Blood）：采用特定的方法將符合要求的獻血者體內(nèi)一定量外周靜脈血采集至塑料血袋內(nèi)，與一定量的保養(yǎng)液混合而成的血液制劑（GB 18469-2012、WS/T 203-2020）。全血制劑的成分與體內(nèi)循環(huán)血液成分基本一致，采集后隨著保存期的延長，全血中血小板及不穩(wěn)定凝血因子逐漸失去生物學(xué)活性。目前臨床應(yīng)用較少，主要用于制備成分血（《全血和成分血使用標(biāo)準(zhǔn)釋義》）。上面是獻血相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的嚴格定義，在臨床和科研實踐中，有用抗凝采血管收集外周血的，也有用濾紙片收集末梢血的，也有用毛細管收集動物眼眶后靜脈血的。
血漿（Plasma）：血漿是血液的非細胞成分，含有水分、無機物、糖類、脂類和蛋白質(zhì)等。血漿中的蛋白質(zhì)主要包含白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子及纖溶蛋白等（《全血和成分血使用標(biāo)準(zhǔn)釋義》）。
血清（Serum）：血凝塊會發(fā)生收縮析出的淡黃色液體，稱為血清（《生理學(xué)》）。血清與血漿的主要區(qū)別是前者不含纖維蛋白原（WS/T 225-2024）。
紅細胞（Red Blood Cell）：紅細胞是血液中的一種無核細胞，正常紅細胞呈雙凹面盤狀。紅細胞是運送氧氣最主要的載體（《全血和成分血使用標(biāo)準(zhǔn)釋義》）。血清和血漿中均不含有紅細胞。
如何制備這些血樣？
全血：全血標(biāo)本的采集同血漿標(biāo)本。全血需盡快分離，未分離的全血在常溫放置會影響其穩(wěn)定，穩(wěn)定時間不超過2 小時（WS/T 225-2024）。注意，全血樣本不需要離心，按照臨床標(biāo)準(zhǔn)采集的全血樣本中含有抗凝劑。
血漿：當(dāng)檢測標(biāo)本類型為血漿時，應(yīng)使用含有抗凝劑的采血管，在標(biāo)本采集完成后應(yīng)立即進行充分混勻，以避免纖維蛋白絲、微小凝塊及血凝塊的形成，同時應(yīng)避免混勻力度過大造成的血細胞損傷/溶血、血小板激活或凝血的發(fā)生�？鼓龢�(biāo)本可以立即離心。實驗室應(yīng)針對所用離心機的類型咨詢采血設(shè)備制造商關(guān)于離心速度和時間的建議。RCF是比RPM更有意義的指標(biāo)，實驗室宜根據(jù)RCF規(guī)定離心的要求，并核查在規(guī)定離心條件下采血管凝膠屏障的完整性（WS/T 225-2024）。在此之前舊標(biāo)準(zhǔn)建議RCF為1000g～1200g，離心時間為5～10min（WS/T 225-2002）。注意，檢測同一項目的血漿，需要使用相同的抗凝劑。
圖1 全血和血漿樣本的制備和區(qū)別
血清：標(biāo)本在離心前應(yīng)保證血液凝固充分，不可手工剝離凝塊。通常在室溫下放置30分鐘至60分鐘可完全凝固，37 ℃水浴可加速血液凝固，冷藏會延遲血液凝固，使用含有促凝劑采血管可明顯縮短血液凝固的時間。如果患者接受抗凝治療，則血液凝固時間會延長（WS/T 225-2024）。關(guān)于離心的部分同血漿。注意，血清樣本一定沒有抗凝劑。
圖2 血清和血漿樣本的區(qū)別
紅細胞：紅細胞成分主要來源是全血采集后經(jīng)離心分離，也可通過血細胞分離機采集制備。常見紅細胞成分包括懸浮紅細胞、濃縮紅細胞、洗滌紅細胞和冰凍解凍去甘油紅細胞等。紅細胞成分也可通過去白細胞處理為去白細胞紅細胞，通過輻照處理成輻照紅細胞（《全血和成分血使用標(biāo)準(zhǔn)釋義》）。不同紅細胞成分的制備可以參考GB 18469-2012。注意，凍存后的全血樣本無法再提取紅細胞，因為全血解凍后易發(fā)生嚴重溶血（紅細胞凍融過程細胞膜漲破）。存儲的紅細胞樣品要盡可能去除水。
紅細胞壓積（Hematocrit，HCT）：紅細胞比容，也可簡稱為PCV（packed cell volume，PCV），是指在一定條件下，經(jīng)離心沉淀壓緊的紅細胞占全血的容積比，是一種間接反映紅細胞數(shù)量、大小及體積的表示方法《全血和成分血使用標(biāo)準(zhǔn)釋義》。簡單來說，將少量抗凝血加入毛細管中，高速離心后，測試管各界面讀數(shù)來計算比容（WS/T 342-2011）。注意，需要使用新鮮的全血檢測紅細胞壓積，凍存后的全血會發(fā)生溶血。
干血斑（Dried Blood Spot，DBS）：使用尖頭器械穿刺或切開皮膚以獲取毛細血管血液（通常稱為末梢血），包含來自小動脈、小靜脈、間質(zhì)和細胞內(nèi)液體的未知比例的血液混合物。皮膚穿刺采血常用于兒科患者少量血液標(biāo)本的采集，還可用于濾紙收集、床旁檢驗等標(biāo)本的采集。手指是成人和年齡較大兒童常用皮膚穿刺部位，對于新生兒和嬰兒宜進行足跟采血制作干血斑（WS/T 225-2024）。也可以在樣本運輸、保存困難的情況下也可用于成人樣本的采集。將采集的各種血液樣品制備成濾紙干血斑，最常用的是用抗凝全血、外周全血和血漿制備濾紙干血斑。用移液器吸取100μl抗凝全血（或血漿）樣品，對準(zhǔn)濾紙印圈的中心處，將樣品滴在濾紙上，或?qū)⒋┐毯笞云つw傷口流出的外周全血直接滴加在濾紙印圈的中心處。在室溫下自然干燥至少4h（潮濕氣候下至少干燥24h），血斑充分干燥后，將其放入密封袋中（《艾滋病性病防治》）。注意，干血斑可能是末梢血，也可能是全血，甚至可能是血漿。但是檢測同一項目的樣品，需要保持一致。
血樣的保存條件和時間？
在文獻檢索的過程，我們發(fā)現(xiàn)一篇2016年的“重量級”的綜述（DOI: 10.1016/j.plefa.2015.12.003），基本上對各種類型的樣本的保存溫度、時間、是否加保護劑等條件進行了全方位的排列組合（Table 1~4）。感興趣的同學(xué)可以下載全文對照一下自己的樣本的收集和保存過程。
對于血清和血漿樣本，室溫下不要暴露超過6個小時，4度可保存6天，-20度可保存1~3年，-80度保存時間可以長達10年。
紅細胞沒有跨度這么長時間的研究，其中最長的是-80度保存4年，-20度下可以保存90天，但是與溫度相比，影響更大的是液體的量，存在越少的水越有利于保存。
在微量管中的全血樣本相對穩(wěn)定性較差，室溫和-20度下僅能保存3天，4度反而能保存30天，在-75度的條件下則能存儲180天。使用濾紙片的全血樣本（干血斑）需要注意密封保存，如果有條件，還可以適當(dāng)添加BHT作為保護劑。如果要長期保存，還是推薦-75度條件。
簡述一下，對于所有樣本類型，最佳的條件是-80度保存。主要是多不飽和脂肪酸（PUFA）會在Fe3+和氧的作用下發(fā)生過氧化從而導(dǎo)致?lián)p失，因此在樣品收集過程中要盡可能減少較高溫度（如室溫）暴露時間、避免開放式放置、避免多次凍融。
當(dāng)然，也會有文獻提出不同的看法，例如2016年的另一篇文章（DOI：10.1016/j.clinms.2016.12.001）提出血清、血漿樣品在室溫下24小時，在4度下至少7天，在20度下至少75天，并且3次凍融循環(huán)均穩(wěn)定�？疾斓闹笜�(biāo)也包括PUFA，但是關(guān)于室溫下的暴露時間，明顯跟綜述有較大區(qū)別。
測脂肪酸用哪種類型的血樣？
事實上，測每種類型的都大有人在。有篇文章（DOI：10.1016/j.plefa.2007.05.003）還專門比較了血漿、紅細胞和全血中脂肪酸的主要存在形式、PUFA、n-3 Index等。發(fā)現(xiàn)血漿和脂蛋白中的脂肪酸譜具有一定可比性，但是與紅細胞中的完全不可比。如果要下一個結(jié)論，就是脂肪酸譜的結(jié)果僅能同類型樣本相比較。
在這篇文章的提示下，我們公司使用4位志愿者同時間點采集的血清和血漿樣本，進行了一次脂肪酸定量檢測，發(fā)現(xiàn)檢測到的脂肪酸種類一致，數(shù)值上血漿中的脂肪酸濃度普遍高于血清，但是這種差異并不顯著。當(dāng)然，由于我們實驗的例數(shù)較少，這個結(jié)果可能不具有普遍性。
這幾年，測紅細胞中脂肪酸的文章不少，而且往往都是用大隊列研究重大疾病的相關(guān)性、早篩早診、發(fā)病機制等，這又是為什么呢？原來血清、血漿中的脂肪酸受膳食攝入影響較大，而紅細胞因為具有較長的半衰期（120天），被認為能更好地反映機體中長期（3周~3個月）脂肪酸攝入狀況，尤其是人體不能合成的必需脂肪酸如n-3脂肪酸（DOI：10.1016/j.plefa.2007.05.003）。所以在營養(yǎng)干預(yù)的研究中，測紅細胞的更多，要定量檢測紅細胞中脂肪酸，除了需要使用新鮮的全血樣本分離紅細胞，還需要記錄全血的體積，并檢測紅細胞壓積來用于定量計算，單位往往是ng/mL或nmol/L。有的科學(xué)研究中也直接使用紅細胞體積用于定量計算。但是，這并不意味著血清或血漿就不適合測脂肪酸，采血前務(wù)必空腹。
測總脂肪酸還是游離脂肪酸？
在生物體內(nèi)大部分脂肪酸都以結(jié)合形式，如甘油三酯、磷脂、膽固醇酯等存在，少量脂肪酸以游離形式存在（DOI：10.1152/physrev.00041.2018）。這些未與甘油、膽固醇等酯化的游離脂肪酸（Free fatty acids, FFA），又可稱為非酯化脂肪酸（Nonesterified fatty acids, NEFA）。正常情況下，血樣中游離脂肪酸的含量極少，僅占總脂肪酸的5%~10%（主要包括油酸、棕櫚酸、硬脂酸等）。血樣中的脂肪酸，大部分以甘油三酯、磷脂、膽固醇酯等存在于脂蛋白中，而脂蛋白濃度極易受飲食影響。
如果要檢測total（總）的脂肪酸，是結(jié)合形式和游離形式之和。樣品制備過程使用酸水解酯鍵，再對羧基進行衍生化，GC-MS檢測。
如果要檢測free（游離）形式的脂肪酸，樣品制備過程不能使用酸或堿水解酯鍵，而是直接對羧基進行衍生化，GC-MS檢測。
關(guān)注營養(yǎng)攝入、脂質(zhì)代謝、MUFA、PUFA、n-3 Index的建議檢測總脂肪酸，而目標(biāo)明確僅關(guān)注某一種脂肪酸的變化及機制研究的建議檢測游離脂肪酸。取決于研究的具體目的和需求，并沒有完全絕對的結(jié)論。
參考文獻：
1.GB 18469-2012全血及成分血質(zhì)量要求
2.WS/T 225-2024臨床化學(xué)檢驗血液標(biāo)本的采集與處理
3.WS/T 225-2002臨床化學(xué)檢驗血液標(biāo)本的采集與處理
4.WS/T 203-2020輸血醫(yī)學(xué)術(shù)語
5.WS/T 342-2011紅細胞比容測定參考方法
6.《全血和成分血使用標(biāo)準(zhǔn)釋義》，人民衛(wèi)生出版社，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所，劉忠
7.《生理學(xué)》，中國中醫(yī)藥出版社，施建蓉、趙鐵建
8.《艾滋病性病防治》，復(fù)旦大學(xué)出版社，杜占聲
9.《艾滋病全程管理與綜合治療實踐》，人民衛(wèi)生出版社，劉壽榮、戚建江
10.The stability of blood fatty acids during storage and potential mechanisms of degradation: A review
11.Fatty acid composition of plasma, blood cells and whole blood: Relevance for the assessment of the fatty acid status in humans
12.Free Fatty Acid Receptors in Health and Disease
